根瘤菌诱变育种在根瘤菌-豆科植物共生体系中的研究进展

王艳霞, 解志红

1.中国科学院烟台海岸带研究所, 山东 烟台 264003;2.中国科学院大学, 北京 100049

根瘤菌与豆科植物共生形成根瘤，当豆科植物产生的黄酮类化合物诱导根瘤菌合成一种分子信号——Nod因子时，共生就开始了，Nod因子刺激根部细胞分裂，导致根瘤器官发生；根瘤菌通过侵入线进入发育中的根瘤细胞，被植物宿主细胞在内吞过程中吸收，并分化为一种独特的类菌体结构，在根瘤内，类菌体通过固氮酶固定大气中的分子氮为豆科植物提供生长所需的氨，植物为类菌体提供碳源，这些碳源被分解以提供固氮所需的能量[1～4]。基于这一共生固氮体系来应对各种环境胁迫进而稳定生态的植物-微生物修复方法已被证明是一种经济可靠且可持续的方法，然而环境因子的限制也是其不能在农业生产上充分发挥作用的重要原因，其中包括土壤营养不足、重金属毒性、土壤盐碱化以及农药污染等限制因子[5～7]。利用豆科植物-根瘤菌共生体系中的固氮作用来提高土壤氮素含量水平并且提高对各种环境因子的耐受力，一直是科研工作者进行土壤恢复的手段之一。

要大幅度提高根瘤菌在生态修复中的应用效果，目前面临的主要问题是：通过何种方法选育出高效固氮的根瘤菌株，来进一步提高根瘤菌的固氮能力、结瘤能力以及抗逆能力等。因此本文围绕通过诱变育种来提高根瘤菌的固氮能力以及在不同环境下的耐受性的相关问题，对国内外相关研究进展进行了归纳总结与分析，探讨了目前存在的一些问题并展望了本领域未来的研究趋向。

1 根瘤菌及其与豆科植物的共生

根瘤菌是指一类能与豆科植物共生、结瘤并固定空气中的氮气供植物营养的重要微生物。它与豆科植物的共生固氮体系是目前微生物与植物之间固氮能力最强、固氮量大、耐受性强的互惠共生关系之一[8]。众所周知,利用根瘤菌和豆科植物共生固氮作用可以增加土壤氮素含量，进而恢复干旱和退化土地的肥力。近几年来，国内外开展了大量对根瘤菌、豆科植物及二者共生体系的研究，其应用主要围绕在将根瘤菌-豆科植物共生体系应用于重金属污染地、农田盐碱地、农药污染地等的生态修复中[9]。

特别是研究者们对根瘤菌自身的重金属抗性、耐盐性及耐酸碱性进行了深入的研究。例如利用豆科植物与根瘤菌共生来减轻重金属的毒性，使植物对过量金属的耐受性更强，并且使植物生物量、发芽率、伸长率、抗氧化能力和金属易位都有所增加[10]。Sánchez 等[11]研究发现，在豆科植物大豆与白羽扇豆上接种慢生型根瘤菌(Bradyrhizobium)，能够促进铜的生物积累并促使其从植物地下部分向地上部分转移，并且减轻了铜对植物的生长抑制，同时增强了植物对过量铜的耐受性。杨培志[12]发现接种根瘤菌可大幅度提高紫花苜蓿对干旱、盐害、高温及根部机械损伤等非生物胁迫的耐受性。然而大多数根瘤菌和豆科植物对重金属等环境因子是非常敏感的，例如当土壤等环境中重金属含量过高时，会破坏根瘤菌细胞内各种生理代谢，包括细胞膜破坏而影响营养物质运输、抑制转录和翻译而影响酶活性以及蛋白质变性等(图1)，因此这些重金属等环境因子对豆科植物和根瘤菌之间互作的影响机制目前还有待进一步研究[14,15]。Sánchez等[16]也发现过量的铜会引起白色羽扇豆和大豆根瘤结节的超微结构损伤，并且限制氮的固定。Benidire等[17]通过研究盐胁迫下不同耐盐性根瘤菌与蚕豆生长的相互关系，发现在较高盐浓度下，接种盐敏感菌株的蚕豆植株的结瘤被抑制，并且固氮能力也较弱。

为了充分发挥根瘤菌在其与豆科植物共生体系中的固氮能力、结瘤能力以及抗逆能力，国内外科学家们逐步开展根瘤菌高效菌株的选育研究工作，尤其是在诱变育种上开展了大量研究。

图1 重金属含量过高对菌体细胞的毒害效应[13]Fig.1 Toxic effects of excessive heavy metal content on bacterial cells[13].

2 根瘤菌的诱变育种

诱变育种是指利用外界物理化学生物因子等因素诱导微生物细胞的基因突变，经诱变处理后，会改变微生物遗传物质DNA和RNA的化学结构，从而引起微生物的遗传变异，并通过某些筛选方法获得所需要的高产、稳产和低耗菌株[18,19]。常规的微生物诱变育种程序一般按照图2所示步骤进行。诱变育种方法主要包括化学诱变、物理诱变和生物诱变。

大部分根瘤菌的菌体革兰氏染色呈阴性，无芽胞，有荚膜，具鞭毛，能运动，其菌落一般呈圆形，颜色大多为乳白色，半透明，边缘光滑整齐，粘稠性较小，在油镜下观察，一般为(0.5～0.9)μm× (1.2～3.0)μm的短杆菌，经诱变后根瘤菌细胞会出现放大或变形[20,21]。鉴于大多数根瘤菌具有严格的宿主专一性，针对不同植物依靠大规模传统筛选发挥固氮和耐受能力都较为突出的理想菌株难度较大[22]。因此，在生产实践中，一般会通过一些诱变方法来获得理想的突变菌株。由于诱变育种具有变异频率高、技术简单、速度快等优点，已经广泛应用于大部分科学研究和工业生产中。赵志山等[23]利用不同剂量快中子的照射来诱变小金黄大豆根瘤菌，发现经诱变根瘤菌侵染的植株的结瘤数、结瘤能力都有显著提高，固氮活力也有不同程度的变化，固氮能力显著增强。除固氮能力外，菌种的耐受能力在诱变选育下也得到提高，同时通过对耐盐基因的挖掘，有助于我们进一步了解其耐盐机理。秦家顺等[24]在一定条件下用紫外线诱变豇豆根瘤菌，由此产生的诱变菌株具有较高地合成IAA的能力，而且其耐盐碱性也有明显提高。Jiang等[25]通过对1株具有耐盐性的中华根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)进行转座子Tn5-1063诱变，获得21个盐敏感突变体，测序鉴定了5个不同的耐盐基因，这对研究提高盐敏感根瘤菌的耐盐性具有重要意义。

图2 诱变育种一般工作程序Fig.2 General working procedures of mutagenesis breeding.

2.1 物理诱变

物理诱变是借助不同的辐射源对微生物进行电离或非电离辐射，是一种应用较早、安全性较高、操作较简便且诱变频率较高的诱变技术[26]。到目前为止，国内外利用物理诱变技术对根瘤菌进行遗传改造的研究已经取得了许多成果，并且在工业生产中得到了一定推广，其中主要诱变因素有激光、紫外线、快中子、微波、离子束等。黄怀琼[27]利用CO2激光辐照处理苕子根瘤菌株，经富集培养分离出诱变菌株，获得结瘤和固氮能力强的诱变菌株；同时分别利用 N2激光和 CO2激光处理慢生型花生根瘤菌株，获得感染力和结瘤性能均优于原菌株的诱变菌株，并且诱变菌株对植物的敏感性较原菌株强，植株的含氮量也有所增加，抗逆性增强。陈今朝等[28]利用一定剂量的紫外线对四季豆、豌豆和花生根瘤菌照射后，发现所有根瘤菌诱变菌株均出现了形态特征和抗性(抗酸碱和抗盐)的改变。

传统的物理因子对根瘤菌的诱变作用强烈，但是可能出现正诱变类型少、诱变株的遗传稳定性较差等现象。近年来，微波诱变、离子注入以及常压室温等离子体(atmospheric room temperature plasma,ARTP)等新型诱变方法由于其安全性和易获得更高的正突变率而在根瘤菌诱变育种中开始应用。李剑峰等[29]利用较高功率的微波诱变红豆草根瘤菌，获得了具有抗生素耐受特性、突变率最高达19%、单株结瘤数高于原始菌株和单株生物量显著增加的诱变菌株，并且显著提高了根瘤菌的固氮结瘤能力。白建军[20]通过对1株山羊豆根瘤菌进行He+注入诱变试验，确定了在250W功率射频下，He+注入15 s时，诱变效果最好，经过SPAD测定发现诱变后菌株的固氮效果显著提高。Cai等[30]采用常压室温等离子体新型诱变技术对苜蓿根瘤菌进行诱变，获得了大量突变菌株，与野生菌株相比，突变株的产VB12能力显著提高，同时对高产突变株的基因组进行测序。付瑞敏等[31]通过低能N+注入诱变技术对高效耐盐石油降解菌株进行诱变处理，获得的突变株不仅遗传性能稳定，而且其耐盐能力和降解石油烃的能力均有较大幅度提升。因此，对根瘤菌进行等离子体诱变育种，并将其应用于修复石油污染的盐渍化土壤具有一定的可行性。

2.2 化学诱变

化学诱变一般是利用各种化学试剂，例如亚硝基胍(nitrosoguanidine,NTG)、嘧啶类似物以及吖啶橙等对菌种进行处理。作为一种经典而传统的诱变方法，它被广泛应用于优良菌种的选育工作中，但此方法具有一定的盲目性、随机性以及污染性，在根瘤菌诱变育种中的应用相对较少，并一般采用亚硝基胍作为诱变剂。曹燕珍等[32]利用亚硝基弧诱变紫云英根瘤菌，发现随着浓度的提高，诱变株对宿主的感染力明显增强。近年来，研究者也已经利用这一诱变方法获得了能够高效固氮的根瘤菌株。张宪武等[33]利用亚硝基弧诱变法获得的大豆根瘤菌突变株具有自身固氮能力，固氮活性高出野生菌株3倍以上。龙敏南等[34]利用吖啶橙诱变花生根瘤菌，筛选出了能使大豆结瘤并具有较高固氮酶活性的根瘤菌诱变株。

利用各种化学诱变剂对微生物进行诱变，操作简便、效果良好、诱变机制比较清晰，它不仅可以诱导微生物产生点突变，而且会导致诸如染色体畸变等的DNA大损伤，但是其最显著的缺点是毒性较大，极易对人体产生危害，因此操作时需加倍小心。目前在根瘤菌的化学诱变中，还没有出现新型的诱变剂，多采用多种化学或物理诱变因子组合的复合诱变方法[35]。

2.3 生物诱变

生物诱变多是以转座子及其衍生物、噬菌体等生物性产品为介质的诱变，尤其是利用转座子的诱变方法在根瘤菌诱变育种研究中被大量应用。通常以Tn5系列的转座子作为转座元件进行诱变，这种转座子是一种常用的在转座过程中有整合体的剪-贴型转座子(图3)，具有转座频率高、转座位点随机、转座后稳定性强以及抗性标记易于筛选等优点。

许多研究者已经利用转座子对不同根瘤菌进行了诱变(表1)。杜秉海等[37]利用含发光酶基因luxAB的Tn5-1063对苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)进行转座子插入诱变，通过结瘤实验筛选出了3个结瘤突变株，其结瘤固氮能力都发生了不同程度的改变。利用转座子诱变不仅可以改变根瘤菌的结瘤固氮能力，而且通过筛选到的敏感性菌株能够进一步研究根瘤菌抗逆性机制。Wahyudi等[36]利用mini-Tn5转座子衍生物诱变慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)，获得了两株对铝酸敏感的突变株并且用以研究慢生型大豆根瘤菌的耐铝酸相关基因，发现耐铝酸基因与结瘤基因并不相关，同时在铝酸胁迫条件下，根瘤菌的耐铝酸机制可能与细菌细胞中铝和磷酸盐的含量有关。马占强[41]利用Tn5-1063a转座子随机诱变苜蓿中华根瘤菌CCNWSX0020，经重金属抗性测定表明筛选出的6株诱变株对Cd和Zn都表现出不同的敏感性，也有4株诱变株对Pb表现出敏感性，并且通过基因测序鉴定了4个与铜抗性相关基因，首次证明了这些基因与苜蓿中华根瘤菌CCNWSX0020抗铜性有关。Liang等[42]利用Tn5转座子对辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumliaoningense)CCNWSX0360 进行随机诱变，分离筛选得到6株铜敏感突变体，并通过鉴定5个铜抗性相关基因，研究了根瘤菌中的铜抗性机制，发现csoR-cueA在铜稳态中起着至关重要的作用，并具有抗锌镉的能力，以及铝胁迫下CueA(重金属转运P型ATP酶)在共生结瘤中发挥重要的作用。Rubio-Sanz等[40]从重金属污染土壤中分离筛选出了1株耐受镍和钴的豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarumbv. viciae)，然后对其进行随机微转座子诱变，产生了14个镍敏感性增加的转座子衍生物，其中有5个转座子对钴更加敏感；同时对基于共生条件下的菌株重金属耐受性的决定因素进行了分析。Hao等[39]通过Tn5转座子诱变紫穗槐中间根瘤菌(Mesorhizobiumamorphae)，产生的铜敏感突变体阐明了在铜胁迫下耐铜性决定因素在共生和植物稳定能力方面的作用；在含铜200 mg/kg的土壤中，接种copA缺陷型菌株能够显著降低刺槐根部结节的氮含量，这一结果表明在高浓度铜的土壤和结节中，根瘤菌经诱变所产生的对铜的耐受性相应地有益于氮固定能力。Moussaid等[38]通过Tn5随机转座子诱变一株具有盐敏感性的鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumciceri)Rch125，分离出12个同时对LiCl、CaCl2和蔗糖显示出更高耐受性的耐盐突变体，经鉴定特定基因功能的丧失会导致盐敏感性根瘤菌的耐盐性增加。Vanderlinde等[43]利用mini-Tn5转座子衍生物来对豌豆根瘤菌进行诱变并分离出一株对干旱非常敏感的突变体，同时与野生菌株相比，该突变体细胞膜中的胞外多糖水平降低，这与耐干旱性降低有关，这项发现对豆科植物在根际环境中的生存具有重要意义。近年来也有研究利用转座子诱变获得的耐药性菌株并应用于生产中。Neeraj等[44]对1株中华根瘤菌(Sinorhizobiumfreddi)进行Tn5转座子的随机诱变处理，发现在较低温度下获得耐药性菌株的几率远高于其自然突变率，并以此耐药性菌株制成的根瘤菌剂的研究也取得了良好的效果。

图3 剪-贴型转座子插入机制Fig.3 Shear-paste transposon insertion mechanism.

表1 不同根瘤菌的转座子诱变育种Table 1 Transposon mutation breeding of different rhizobium.

2.4 复合诱变

菌种诱变机制比较复杂，单一诱变往往难以达到预期目的。因此，目前也有研究者在进行根瘤菌诱变育种时往往采用2 种或者2 种以上诱变剂协同组合的育种方法，即复合诱变法。这种方法可在一定程度上提高诱变的目的性和针对性，并且更容易筛选到具有有利性状的正向突变菌株，因此越来越广泛应用于相关诱变育种研究中。Pan等[45]对放射型根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)先用紫外线照射再用NTG处理，正突变率提高，辅酶Q10的产量增幅也变大，试验证明紫外线与NTG协同复合诱变的效果要优于单独紫外线照射或NTG诱变。曹燕妮[46]通过紫外一氯化锂和超声波处理对豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)进行诱变，发现氯化锂作为助诱剂能显著提高正突变率，并且增加正突变菌株数量。Liu等[47]对鲁氏酵母菌(CRZ-0)进行紫外-硫酸二乙酯(UV-DES)协同诱变处理，获得了Cd2+抗性及生物累积能力提高的诱变菌株。杨利擎[47]利用多种诱变方法对具有重金属耐受性的菌株进行诱变育种，筛选获得的诱变株的重金属耐受能力增强，在进行菌种鉴定后用于处理重金属污染[48]。夏钱华等[49]通过紫外-微波复合诱变，对石油降解菌Enterobactersp. MX1进行诱变，获得的诱变株MXU2W2 降解柴油率比原菌提高了16.96%。有研究者利用γ-射线、微波和化学诱变剂复合处理花生和大豆根瘤菌，接种到玉米和小麦上，显著提高了植株的结瘤数[50]。

3 展望

根瘤菌的诱变育种研究在改善豆科植物-根瘤菌共生效应中具有重大意义，不仅可以提高植株的结瘤固氮能力，而且也提高了根瘤菌的抗逆性。目前，根瘤菌的选育手段除了上文提到的诱变育种技术还有一些新型的选育技术，例如：原生质体融合技术、基因工程技术等，但由于各种现实条件的限制，包括外界环境限制、基础知识薄弱、研究投资大、技术门槛高等，这些新型选育技术的研究较少，也很难应用于大规模生产中。因此，常规的诱变和筛选方法在根瘤菌育种工作中仍被广泛使用，依旧占主导地位。

伴随国内外研究的不断深入，根瘤菌诱变育种技术也逐渐从研究试验阶段走向了实际应用，但在具体研究应用中始终存在着一些问题，如有关根瘤菌诱变原理等基础领域方面的研究还较少，导致国内对于这一根瘤菌选育方法的应用范围不够广泛；诱变菌的不稳定及其使用安全性等问题需进一步克服和完善；诱变菌固氮能力及抗逆性在后续传代中的遗传稳定性问题；以及如何在研究中提高诱变菌的筛选效率并且获得增效诱变等等。因此，目前科研工作者仍需要加强对根瘤菌与植物之间共生固氮作用提高抗逆性的机理以及根瘤菌诱变机理等基础性研究，进一步开发设计根瘤菌的高效筛选技术例如高通量筛选技术，以缩短育种周期和降低成本，并提高筛选效率，同时要积极探索定向诱变途径。随着育种学、遗传学、分子生物学、生物信息学以及系统学等学科的飞速发展、互相渗透与合作，将促进高效固氮抗逆根瘤菌的菌种选育工作从传统的经验性随机筛选演变为更加严密、合理的系统化选育。也将会出现大量具有实用价值的高效固氮抗逆根瘤菌菌种，并不断形成应用于生产实际的优良多效的根瘤菌剂产品。