蜘蛛香35%乙醇提取物的肠吸收特性

何 帅， 马晓杰， 贺 蕊， 龚慕辛， 石晋丽∗

（1.北京中医药大学中药学院，北京102488；2.首都医科大学中医药学院，北京100069）

随着社会竞争日趋激烈及生活压力不断加大，焦虑症已成为常见病和多发病。蜘蛛香为败酱科缬草属植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的干燥根及根茎，又名马蹄香、鬼见愁、豆菜根等，具有理气和中、散寒除湿、活血消肿功效，用于治疗脘腹胀痛、呕吐泄泻、风寒湿痹、小儿疳积等［1-3］，其化学成分包括环烯醚萜、黄酮、苯丙素、挥发油等［4-5］，具有抗焦虑、抗抑郁、镇静催眠、镇痛、抑制胃肠道痉挛、细胞毒性、抗肿瘤等作用［6］。

研究表明，蜘蛛香35%乙醇提取物具有明确的抗焦虑药效，但其药效物质基础尚不明确。因此，本实验考察该提取物肠吸收特性，以期全面考察蜘蛛香临床疗效的物质基础，也为中药整体质量评价研究提供新思路。

1 材料

1.1 仪器 HH-4数显恒温水浴锅 （金坛市杰瑞尔电器有限公司）；BT100-1F蠕动泵 （保定兰格恒流泵有限公司）；电子分析天平 （十万分之一，德国Sartorius公司）；Waters 2695-2996高效液相色谱系统、Empower工作站 （配置四元梯度泵、自动进样器，美国 Waters公司）；TTL-DCⅡ型氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；H1650台式高速离心机 （长沙湘仪离心机仪器有限公司）；KQ-100E超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；冷冻干燥机 （北京博医康实验仪器有限公司）；氮气 （北京日月金铎气体有限公司）。

1.2 试药 新绿原酸 （批号MUST-17011001）、绿原酸 （批号MUST-17030620）、隐绿原酸 （批号MUST-17022403）、异绿原酸A （批号17030621）、异绿原酸B （批号MUST-15081411）、橙皮苷 （批号MUST-17032502）、异绿原酸 C（批号 MUST-15081414）对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司。氯化钾、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、葡萄糖、氯化镁、氯化钙均为分析纯 （北京化学试剂公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯 （美国Fisher公司）；纯净水 （杭州娃哈哈集团有限公司）。蜘蛛香采自云南永平，经北京中医药大学石晋丽教授鉴定为败酱科植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的干燥根茎和根。

1.3 动物 SPF级SD大鼠，雄性，体质量（280±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2016-0006，饲养于动物房 ［室温 （22±2）℃、相对湿度 50%左右］，自由摄食饮水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 Krebs-Ringer缓冲液 （K-R液） 参考文献 ［7］ 报道。

2.1.2 对照品溶液 精密称取各对照品，无水甲醇配制成1.0 mg／mL贮备液，混合后制成不同质量浓度对照品溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液 药材粉碎后过3号筛，10倍量35%乙醇分别回流提取0.5、1.5、1 h，趁热抽滤，合并滤液，60℃减压回收乙醇，转移至蒸发皿中，65℃烘箱中真空干燥，得干膏，粉碎研磨后备用。临用前精密称取适量，K-R液超声溶解30 min， 配制成低（0.05 g／mL）、 中 （0.1 g／mL）、高 （0.15 g／mL） 质量浓度混悬液 （均以生药量计）， 4 500 r／min 离心 10 min， 澄清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得，置于液相小瓶中备用。

2.2 手术取样 参考文献 ［8-9］报道。

2.3 样品处理 取各时间点样品200 μL，冷冻干燥后加 200 μL甲醇涡旋混匀，超声 30 min后4 500 r／min离心 10 min， 取上清液， 0.22 μm 微孔滤膜过滤待测。

2.4 色谱条件 采用HPLC分析。Agilent ZORBAXSB-C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流动相乙腈 （A）-水 （含0.1%甲酸） （B）， 梯度洗脱（0～8 min， 2% ～5%A； 8～12 min， 5%A； 12～25 min， 5% ～12.5%A； 25～47 min， 12.5% ～18%A； 47～68 min， 18% ～30%A； 68～73 min， 30% ～57.5%A）；体积流量1 mL／min；柱温30℃；检测波长285 nm；进样量10 μL。

2.5 Ka、Papp计 算 公 式 分 别 为 Ka＝其中l为肠段长度，r为肠段内半径，v为灌流速度，Cin、Cout分别为药物进、出口质量浓度，Vin、Vout分别为每 15 min灌流入肠、出肠的供试液体积。

2.6 统计学分析 通过SPSS 20.0软件进行处理，组间数据比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.7 方法学考察

2.7.1 稳定性考察 按 “2.2”项下方法进行在体单向肠灌流实验，收集空白肠灌流液，以其为溶剂溶解提取物粉末以配制药液，置于一密闭容器中，37℃水浴孵育2 h，于0、30、120 min各取样200 μL，在 “2.4”项色谱条件下进样测定，计算剩余百分率，测得各成分RSD均＜3%，表明2 h内药液稳定性良好。

2.7.2 专属性考察 取空白灌流液、对照品溶液、提取物灌流液，在 “2.4”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由图可知，各成分峰形良好，均能得到完全分离，空白灌流液和提取物中其他成分无干扰，表明方法专属性较好。

图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.7.3 精密度试验 取肠灌流样品，按 “2.3”项下方法处理，在 “2.4”项色谱条件下进样测定6次，测得各成分峰面积RSD分别为新绿原酸2.66%、绿原酸2.37%、隐绿原酸2.37%、异绿原酸B 2.29%、异绿原酸A 2.34%、橙皮苷2.67%、异绿原酸C 2.32%，表明仪器精密度良好。

2.7.4 稳定性试验 取肠灌流样品，于0、2、4、8、16、24 h在 “2.4”项色谱条件下进样测定，测得各成分峰面积RSD分别为新绿原酸1.80%、绿原酸1.55%、隐绿原酸1.93%、异绿原酸 B 1.80%、异绿原酸A 1.32%、橙皮苷1.49%、异绿原酸C 1.44%，表明灌流液在24 h内稳定性良好。

2.7.5 重复性试验 取肠灌流样品6份，按“2.3”项下方法处理，在 “2.4”项色谱条件下进样测定，测得各成分峰面积RSD分别为新绿原酸1.49%、绿原酸1.39%、隐绿原酸1.47%、异绿原酸B 1.39%、异绿原酸A 1.29%、橙皮苷2.02%、异绿原酸C 2.22%，表明该方法重复性良好。

2.7.6 线性关系考察 精密称取各对照品适量，无水甲醇制成1.0 mg／mL贮备液，甲醇稀释成不同质量浓度，精密吸取200 μL，氮气吹干后加入200 μL空白肠灌流液，超声30 min，冷冻干燥后加 200μL甲醇，超声 30min充分溶解，4 500 r／min离心 10 min， 移取上清液， 0.22 μm 微孔滤膜过滤，在 “2.4”项色谱条件下进样10 μL测定。以峰面积为纵坐标 （Y），质量浓度为横坐标 （X）进行线性回归，结果见表1，可知各成分线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.7.7 加样回收率试验 取75 min肠灌流样品4份，1份供含有量测定用，其他3份精密加入对照品贮备液稀释液 （50%甲醇稀释），使对照品加入量与样品中成分含有量基本相等，超声混匀后按“2.3”项下方法处理，在 “2.4”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、橙皮苷、异绿原酸C平均加样回收率分别为98.88%、104.55%、98.16%、98.65%、94.78%、93.70%、89.60%，RSD分别为 6.46%、6.74%、7.96%、5.46%、2.57%、1.70%、2.26%。

2.8 肠吸收研究

2.8.1 提取物在体单向肠灌流 见图2。

图2 提取物HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of extract

2.8.2 吸收参数 研究表明［10］，当某药物在大鼠体内的平均 Papp小于 0.18×10－3cm／min 或大于1.2×10－3cm／min时， 分别为吸收差、 吸收完全；大于0.18×10－3cm／min 但小于1.2×10－3cm／min 时，为中等吸收。

表2～3显示，橙皮苷中、高质量浓度 （1.0、1.5 g／mL） 下的 Papp仅略大于 0.2×10－3cm／min，吸收相对较差；随着质量浓度增加，异绿原酸A吸收参数有先升高后下降的趋势，橙皮苷显著降低（P＜0.01），而其他成分无明显变化。

表2 各成分Ka值 （±s）Tab.2 Kavalues of various constituents（±s）

表2 各成分Ka值 （±s）Tab.2 Kavalues of various constituents（±s）

注：与 1.5 g／mL 比较，∗∗P＜0.01

成分 Ka（×10－3／min）0.5 g／mL 1.0 g／mL 1.5 g／mL新绿原酸 4.016±0.356 4.383±0.138 4.428±0.271绿原酸 4.302±0.663 4.209±0.216 4.315±0.224隐绿原酸 3.498±0.955 3.595±0.433 3.603±0.142异绿原酸 B 3.589±0.130 3.807±0.529 3.692±0.218异绿原酸 A 4.778±1.281 5.040±0.402 3.686±0.332橙皮苷 6.280 ±1.453∗∗ 2.233 ±0.465 2.301±0.129异绿原酸 C 4.611±0.750 4.633±0.173 4.535±0.254

表3 各成分Papp值 （±s）Tab.3 Pappvalues of various constituents（±s）

表3 各成分Papp值 （±s）Tab.3 Pappvalues of various constituents（±s）

注：与 1.5 g／mL 比较，∗∗P＜0.01

成分 Papp［×10－3／（cm·min－1）］0.5 g／mL 1.0 g／mL 1.5 g／mL新绿原酸 0.556±0.043 0.514±0.015 0.554±0.011绿原酸 0.551±0.085 0.491±0.019 0.531±0.074隐绿原酸 0.391±0.011 0.413±0.064 0.452±0.047异绿原酸 B 0.404±0.016 0.444±0.083 0.465±0.010异绿原酸 A 0.596±0.190 0.611±0.048 0.465±0.041橙皮苷 0.799±0.187∗∗ 0.245±0.055 0.257±0.017异绿原酸 C 0.579±0.115 0.539±0.023 0.589±0.068

2.8.3 P-糖蛋白抑制剂对提取物肠吸收特性的影响 在提取物灌流液的K-R液 （pH＝7.4）中加入P-糖蛋白抑制剂 （维拉帕米）至1.0 g／mL（相当于中剂量组），制成混悬液，4 500 r／min离心10 min，去澄清药液备用。按 “2.2”项下方法进行实验，在 “2.4”项色谱条件下进样测定，结果见图3。由图可知，各时间点对应的11个色谱峰峰面积较图2明显减小。

然后，按 “2.5”项下公式计算吸收参数，结果见表4～5。由表可知，加入维拉帕米后各成分吸收参数均显著提高 （P＜0.01），其中异绿原酸A、B、 C 的 Papp大于 1.2×10－3cm／min， 表明其吸收良好。

3 讨论

图3 提取物 （含维拉帕米）HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of extract（including verapamil）

表4 各成分 （含维拉帕米）Ka值 （±s）Tab.4 Kavalues of various constituents（including verapamil） （±s）

表4 各成分 （含维拉帕米）Ka值 （±s）Tab.4 Kavalues of various constituents（including verapamil） （±s）

注：与未加维拉帕米比较，∗∗P＜0.01

成分 Ka（×10－3／min）1.0 g／mL 1.0 g／mL（含维拉帕米）新绿原酸 4.383±0.138 7.049±0.408∗∗绿原酸 4.209±0.216 7.690±1.548∗∗隐绿原酸 3.595±0.433 6.494±1.181∗∗异绿原酸 B 3.807±0.529 8.421±0.825∗∗异绿原酸 A 5.040±0.402 7.808±1.071∗∗橙皮苷 2.233±0.465 5.551±0.159∗∗异绿原酸 C 4.633±0.173 9.477±1.052∗∗

表5 各成分 （含维拉帕米）Papp值 （±s）Tab.5 Pappvalues of various constituents（including verapamil） （±s）

表5 各成分 （含维拉帕米）Papp值 （±s）Tab.5 Pappvalues of various constituents（including verapamil） （±s）

注：与未加维拉帕米比较，∗∗P＜0.01

成分 Papp［×10－3／（cm·min－1）］1.0 g／mL 1.0 g／mL（含维拉帕米）新绿原酸 0.514±0.015 0.976±0.053∗∗绿原酸 0.491±0.019 1.095±0.027∗∗隐绿原酸 0.413±0.064 0.894±0.106∗∗异绿原酸 B 0.444±0.083 1.253±0.215∗∗异绿原酸 A 0.393±0.094 1.419±0.635∗∗橙皮苷 0.245±0.055 0.745±0.066∗∗异绿原酸 C 0.539±0.023 1.835±0.548∗∗

研究表明，蜘蛛香35%、95%乙醇提取物均具有明显抗焦虑作用，且前者更稳定，并发现其中含有黄酮类成分，如50 mg／kg橙皮苷具有抗焦虑活性，但其药效物质基础不明确［11-12］。本实验发现，蜘蛛香35%乙醇提取物中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、橙皮苷、异绿原酸C均可吸收入肠，为中等吸收，初步认为是有效成分，其中绿原酸、新绿原酸存在良好的吸收。文献 ［13-14］报道，绿原酸在小肠中可通过存在于肠道黏膜刷状缘的β-葡糖糖酶、酯酶的水解作用断裂酯键，分别形成奎尼酸、咖啡酸，后者可部分被肠道吸收，而未被吸收者发生甲基化反应生成阿魏酸和异阿魏酸，被吸收或经肝脏排出体外，推测提取物中其他成分可能通过影响小肠中相关酶的活性来影响绿原酸吸收。另外，橙皮苷、异绿原酸A吸收受其质量浓度抑制，表明其吸收机制可能为主动运输；其余5种成分吸收不受其质量浓度影响，为自由扩散。

P-糖蛋白为限制药物肠道吸收的主要因素，与药物结合时能使后者外排出细胞而影响吸收，导致其质量浓度降低，影响药效发挥［15］。在蜘蛛香35%乙醇提取物溶液中加入P-糖蛋白抑制剂维拉帕米后7种成分的吸收参数均增大，表明它们均为P-糖蛋白底物。维拉帕米可通过抑制P-糖蛋白对各成分的外排泵作用来提高其在小肠的吸收，但促进程度不同，表明与后者的结合能力存在差异。