大鼠在急性肺损伤中炎症因子的表达及病理损伤

热依拉·牙合甫 吐尔逊娜·买买提 李瑞晟 努尔阿米娜·铁力瓦尔迪

阿帕尔·卡哈尔1 王琴1 范桂君1（通讯作者)

（1新疆医科大学第二附属医院老干科 新疆 乌鲁木齐 830000）

（2新疆医科大学第三临床学院/新疆医科大学附属肿瘤医院病理科 新疆 乌鲁木齐 830011）

（3新疆医科大学第二附属医院呼吸科 新疆 乌鲁木齐 830000）

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)是临床常见的危重急症，是由多种肺内外致病危险因子导致的以血管通透性增加、透明膜形成为主要表现的炎症综合征，死亡率可高达50%～70%。

1.资料与方法

1.1 模型资料

选择清洁型大鼠3月龄20只（新疆医科大学实验动物中心提供）体重约（220±50g），随机分为：空白对照组（10只，简称K组，尾静脉注射生理盐水）；模型组（10只，简称L组，尾静脉注射脂多糖6mg/kg）：

1.2 建模方法

（1）L组使用脂多糖(6mg/kg)稀释成0.5ml进行大鼠尾静脉注射，K组使用0.5ml生理盐水大鼠尾静脉注射。（2）各组分为2小时、4小时、8小时3个时间点注射脂多糖（L组）和生理盐水（K组），注射后2小时每组处死3只、4小时每组处死3只、8小时每组处死4只。

1.3 标本获取方法

使用大鼠左肺进行灌洗取灌洗液，使用大鼠右肺下叶进行病理学观察，使用大鼠右肺上叶及中叶进行NF-KB测定。处死动物后全暴露法打开动物胸腔，摘除右肺后结扎右肺支气管，自喉部对气管执行气管插管，用生理盐水以大鼠体重的10%剂量的生理盐水分3次进行支气管肺泡灌洗，回收率不少于70%。回收灌洗液置于15ml离心管中以2000转离心10min，取上清液，储存于-80℃冰箱备用。取大鼠右肺下叶，沿支气管使用6号套管针注人10%中性福尔马林液，无菌箱中静置待肺叶僵固，使用10%中性福尔马林液浸泡固定，3d后切片，HE染色。大鼠右肺上叶、中叶置入EP管放入液氮中拟查NF-kB用。

1.4 观察方法

1.4.1 病理学观察 选择大鼠右肺下叶组织，使用HE染色，每个标本形成10个玻片，2名病理科医师双盲状态下使用200倍光镜观察，采用Arold评分方法对肺水肿、肺泡及间质炎症、肺泡及间质出血、肺不张、透明膜形成5个检查项分别进行0～4分的主观定量评分：标本无损伤0分，满视野为4分，总肺损伤评分为上述各项之和。

1.4.2 肺组织NF-KB测定 将冷冻肺组织与液氮合并充分碾磨；混合物置入组织匀浆器，加入5ml细胞裂解液，移至4ml离心管中，2000r/min状态下离心30s后移除示碎组织；上清液使用4ml离心管干冰孵育5min，5000r/min状态下离心5min取沉淀（核团）；核团重悬于100ul胞核裂解液中，震荡15s，干冰孵育30min；裂解后的核团移至微离心试管中，14000r/min状态下离心2min；上清液含DNA结合蛋白，液氮速冻，-80℃下保存备用。采用Western blot法检测肺组织细胞NF-KBp65的表达。检测组核蛋白中NF-kBp65的表达差异。

表1 病理学结果比较图 （±s）

表1 病理学结果比较图 （±s）

分组n肺水肿炎症出血肺不张透明膜平均空白组（K）100.23±0.020.36±0.030.11±0.010.02±0.000.03±0.000.15±0.02模型组（L）103.11±0.253.15±0.232.96±0.172.37±0.112.66±0.132.85±0.18 t-9.9969.9949.9979.9919.9929.994 P-＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05

1.4.3 支气管肺泡灌洗液中TNF-a、IL-1β的ELISA测定

采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定支气管肺泡灌洗液中TNF-a、IL-lβ的含量。

2.结果

2.1 病理学结果

模型组（L组）肺水肿、肺泡及间质炎症、肺泡及间质出血、肺不张、透明膜形成5个检查项评分显著高于空白组（K组），具有显著差异（P＜0.05）。详见表1。

图1 模型组大鼠典型切片

2.2 肺组织NF-KB测定结果

空白组（K组）未检测出肺组织NF-KB阳性，模型组（L组）均检测出肺组织NF-KB阳性，t=9.999，P＜0.05，存在显著统计学差异，见表2。

表2 两组肺组织NF-KB测定结果对比表 [n（%）]

2.3 支气管肺泡灌洗液中TNF-a、IL-1β的ELISA测定结果

空白组（K组）未检测出TNF-a阳性，检测出1例（10.0%）IL-1β阳性，模型组（L组）检测出2例（20.0%）TNF-a阳性，检测出7例（70.0%）IL-1β阳性，t＞9.000，P＜0.05，存在显著统计学差异，见表3。

表3 两组支气管肺泡灌洗液中TNF-a、IL-1β结果对比表 [n（%）]

3.讨论

本文研究数据中，急性肺损伤大鼠的TNF-a阳性数据显著高于空白组。证实急性肺损伤过程较容易形成肺部的恶性肿瘤。同时，急性肺损伤大鼠的IL-1β表现显著高于空白组说明急性肺损伤患者患肺炎的概率显著高于普通患者。肺组织NF-KB监测及肺组织病理监测并未给出典型性的监测对比结构，其监测结果可以支持本文研究中肺急性损伤大鼠罹患肺部肿瘤及肺部炎症的概率显著增加。