高分辨质谱及组学分析在小曲白酒风味成分差异鉴别上的应用

2019-03-30曹倩雯孙细珍刘源才

酿酒科技 2019年3期

王喆，曹倩雯，韩娇，孙细珍，刘源才

（1.劲牌有限公司，湖北黄石435100；2.中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北黄石435100）

中国白酒中物质十分丰富，其中主体成分酒精与水的含量占总量的97%～98%，风味微量成分占2%～3%[1]，但是其种类众多，决定了酒体的香型差异。根据化学性质不同，可以将酒中的风味物质分为醇类、醛类、酸类、酯类、酮类化合物、硫化物、缩醛类化合物、吡嗪类化合物、呋喃类化合物、芳香族化合物以及其他化合物。白酒中的各种风味物质含量从每升中几纳克到几百毫克不等，对其准确定量非常困难。现有的分析方法主要有气相色谱-质谱[2-3，11-12]、多维气相色谱-质谱[4-5]、气相色谱-闻香[6-8]、二维气相色谱-飞行时间质谱[9-10]，以上分析方法主要基于气相色谱与质谱串联的分析方法，分析的对象以挥发、半挥发类物质为主。白酒中还有一部分不挥发的物质，其中大部分不挥发物质以酸类物质为主，是白酒中重要风味物质，构成白酒风味的骨架成分[13-14]，基于气相色谱的分析方法无法进行检测。小曲白酒作为中国保健酒第一品牌的中国劲酒的主要原料，为了不断提升中国劲酒口感与品质，对其挥发性成分做了较为系统的研究，对其不挥发风味成分的研究才刚刚开始。

新工艺原酒其生产过程是采用机械化生产工艺，生产用酒曲使用的是纯种培养，然后按比例混合的混合曲，其保持了传统工艺原酒风格，同时口感更加纯净。为了明确两种原酒口感差异的物质基础，本工作采用超高效液相色谱和基于Orbitrap高分辨质谱技术[17，19，24]的台式质谱仪，结合组学分析[15-16，18]软件 Compound Discoverer2.0，对不同工艺生产的小曲白酒中的不挥发风味物质进行分析，聚焦于其中的标志性差异化合物，期望为小曲白酒酿造工艺升级、酿造微生物选择，提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：劲牌有限公司生产。A酒样为新工艺混合曲生产原酒，生产线上抽取10个批次；B酒样为传统工艺传统曲生产原酒，生产线上抽取10个批次。

试剂：甲酸铵、甲醇、甲酸，以上试剂均为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）、高纯氮气（99.999%，武钢生产）。

仪器设备：Ultimate 3000 RSLC超高效液相色谱仪联用Q Exactive MS台式高分辨质谱仪（配有Compound Discoverer 2.0数据处理系统），美国赛默飞世尔公司。

1.2 试验方法

1.2.1 供试品溶液制备

取0.5 mL酒样过0.22 μm有机膜，作为供试品溶液待用。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：Accucore C18(100×2.1 mm，2.6µm)；柱温：30 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：5 µL；流动相：水相（W）5 mM甲酸铵以及0.1%甲酸水溶液，有机相（M）5 mM甲酸铵以及0.1%甲酸甲醇溶液；A相流动相组成为98∶2（W∶M），B相流动相组成为2∶98（W∶M），A相浓度洗脱梯度：0～1 min，100%；1～6 min，1000%～50%；6～15 min，50%～0%。1.2.3 质谱条件

离子源（HESI，正负切换）；喷雾电压：3000 V(+)，2500(-)；离子源温度：300 ℃；鞘气气压：35 arb；辅助气压：10 arb；毛细管温度：350℃。质谱扫描模式：Full MS-ddMS2(TOP 3)；扫描范围：100～900 m/z；分辨率：70000(FWHM)at m/z 200，Full MS-17500(FWHM)at m/z 200，MS/MS；扫描间隔：2.0 m/z。

1.3 数据分析

采用 Compound Discoverer 2.0（简称 CD2.0）对组分进行提取、过滤及统计学分析。

2 结果与分析

2.1 色谱分离条件考察

为保证白酒样品中尽可能多的成分能够有效地被测定，对色谱分析条件进行了摸索，从图1可以看出，绝大多数化合物出峰时间在5 min之后，且各组分分布均匀，表明色谱条件选择合适。从图2可以看出，横坐标为保留时间，纵坐标为分子量，结果显示在所采用的色谱条件下，化合物的出峰时间合适，其分布较为均匀。

图1 两种工艺酒样的轮廓图

2.2 数据重现性考察

在代谢组学[20-22，25]相关试验中，方法的重现性至关重要，需要保证数据在质量精度、保留时间及响应强度等方面具有很好的重现性。本实验在进样序列中穿插了质控样品，对系统的稳定性进行了考查。质控样品的相关检测数据见表1。

图2 不同化合物保留时间分布图

表1 质控样检测数据

从表1可以看出，实际检测过程中，保留时间偏差≤0.05 min，峰面积的RSD为2.1%，质量精度的偏差≤1.5 mg/L，数据重现性符合要求。

图3为化合物（m/z149.09609）提取后的色谱图，利用其保留时间和峰面积，考查色谱的稳定性；图4为化合物（m/z149.09609）质谱图，利用其m/z考察质谱的稳定性。

图3 化合物（m/z149.09609）XIC图

从图3、图4可以看出，在整个进样周期内，以某一化合物（m/z149.09609）理论值考查的保留时间(RT)偏差＜0.05 min，峰面积的RSD为2%左右，质量精度的偏差在1.5 mg/L以内，表明系统有良好的稳定性、重现性和质量精度。

图4 化合物质谱图

2.3 不同原酒风味物质差异统计学分析

采用CD 2.0软件对组分峰进行提取和过滤，确定以P-Value＜0.05，Fold Change=2对峰进行过滤。Fold Change=2排除差异较小的化合物，PValue统计学中的假设检验，p值是将观察结果认为有效即具有总体代表性的犯错概率。

图5 两种原酒的火山图

图5为两种工艺原酒组分分析的火山图，从图5可以看出，A组内的组分差异要比B组内组分差异要小。是由于传统工艺所用酒曲为自然接种的传统曲，其中混入了杂菌，导致酒体中的杂味物质较多。新工艺原酒生产采用的机械化生产工艺和纯种培养的混合曲，生产过程控制较好，故酒体杂质少，且酒的品质均一和稳定性要好。

表2 差异化合物鉴定表

主成分分析（PCA分析），是一种分析、简化数据集的技术。主成分分析经常用于减少数据集的维数，同时保持数据集中的对方差贡献最大的特征。这是通过保留低阶主成分，忽略高阶主成分做到的。这样低阶成分往往能够保留住数据的最重要方面。

通过对有显著性差异的化合物做PCA分析，将样品的特征量压缩，在低纬度空间反映样品之间的关系。

图6 两种原酒PCA分析图

图6是两种原酒的组分PCA分析图，从图6可以看出，两种样品可以清晰的按照生产工艺区分为两组，说明不同生产工艺所生产的样品所含成分有一定差异，且B组样品组内差异比A组大。

2.4 差异化合物鉴定

找出两组样品中有差异的化合物，可以明确两种原酒口感差异的物质基础，为工艺以及酒曲配方升级提供依据。根据标记物的精确质量数、同位素分布和二级碎片离子等信息，采用CD2.0软件和ChemSpider[19-20]、mzCloud 网络数据库[24]对有差异的化合物进行了鉴定和确证。鉴定结果见表2。

图7是两种不同工艺原酒中标志性差异化合物的峰面积箱型图，以峰面积差在两倍以上为筛选条件，筛选出了7种标志性差异成分。

从图7a至图7f可以看出，苯乙酮、戊二酸、茴香脑、香草酸、癸二酸二甲酯、2,6-二甲基-4-吡喃酮为B组内的标志性成分，显著高于A组。从图7g可以看出，4-异丁基苯甲酸为A组内标志性成分，显著高于B组。

3 结论

对小曲白酒的质量鉴别现主要采用对挥发性风味物质的分析、鉴别。为了评价小曲白酒中不挥发性物质对小曲白酒品质的影响，采用超高效液相色谱和Orbitrap高分辨质谱仪，对不同工艺小曲白酒中不挥发性成分作了分析。通过组学分析软件从众多不挥发性成分中筛选出差异明显的物质，明确了新工艺混合曲与传统工艺曲生产的原酒之间差异的不挥发性物质基础。根据其精确质量数、同位素分布、二级碎片离子信息，采用CD2.0软件和chemspider进行了鉴定，其为苯乙酮、戊二酸、茴香脑、香草酸、癸二酸二甲酯、2,6-二甲基-4-吡喃酮、4-异丁基苯甲酸7种化合物。

通过不挥发性物质的分析和采用组学分析的手段，对不同工艺的小曲白酒的鉴别，能够明显区分两种工艺小曲白酒，为小曲白酒的品质鉴别、生产一线原酒分级提供了一种解决思路，能有效缓解生产一线原酒品评员不足的问题。