芝麻香型白酒中健康功能因子四甲基吡嗪测定方法的对比研究

司冠儒，张温清，饶志明，于海波，孔 帅，段亮亮，叶 明，周 萍

（1.安徽宣酒集团股份有限公司，江南小窖酿造工艺研究所，安徽宣城242000；2.合肥工业大学，食品科学与工程学院，安徽合肥230009；3.江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122）

吡嗪类化合物是一类含1,4-二氮杂苯母环化合物的总称，广泛存在于自然和发酵食品中，具有类似于炒坚果、烤肉的怡人香气，香气透散性好，对其他香味有显著的烘托和叠加作用。四甲基吡嗪(TTMP)，又名川芎嗪，是一种重要的吡嗪化合物。它作为中药材川穹根茎的主要活性生物碱成分，具有特殊的药理作用。研究表明，TTMP具有扩张血管、改变血循环、护肝（防止酒精对胃黏膜和肝脏的损伤）等功能[1-2]。酱香型、兼香型和芝麻香型白酒中富含吡嗪类物质，特别是TTMP，其主要由发酵过程中微生物代谢产生，是中国白酒中的健康风味成分，为“适量饮酒，有益健康”提供了依据[3-4]。

近年来，针对白酒中TTMP检测方法的研究已有很多的相关报道，气相色谱技术、液相色谱技术及气质联用技术均应用于该领域中[5-7]。建立简便准确的TTMP含量测定方法，对进行白酒中TTMP的研究工作，白酒厂日常的分析检验及自身品牌提升具有重要的意义。本研究团队前期针对芝麻香型白酒中TTMP做了系统的研究，相继开发了TTMP检测的气相色谱法、液相色谱法和液相色谱质谱联用法，并对芝麻香型白酒整个生产工艺过程中TTMP的产生机理进行了深入的研究[8-11]。本文拟对气相色谱技术、液相色谱技术和液相色谱质谱联用技术定量检测芝麻香型白酒中TTMP的方法进行研究，分析3种方法的优缺点，以期为不同兄弟厂家根据自身的设备配置和人员素质建立TTMP的日常分析检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：待测酒样均为本厂产芝麻香型白酒。

仪器设备：气相色谱仪，日本SHIMADZU GC-2010 Plus，配有 FID 检测器；色谱柱，Varian，CP 97723A，50 m×0.25 mm×0.39 mm；氢气发生器QL-500，山东赛克赛斯氢能源有限公司；空气发生器HGA-5L，北京汇龙公司；高纯氮气，南京特种气体有限公司；液相色谱仪，美国Angilent 1200；色谱柱，Phenomenex Gemini 5 μm C18110A(250×4.60 mm)；液相色谱质谱联用仪，美国Angilent 1260-6460；色谱柱，Angilent Eclipse Plus C183.5 μm(4.6×100 mm)；电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限责任公司；微量进样器，日本SHIMADZU。

试剂：内标2-乙基丁酸，购于天津市光复精细化工研究所；TTMP（2,3,5,6-TTMP）购自sigma公司；色谱级乙醇、甲醇购于ANPEL公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标样的制备

准确称取一定量的TTMP于容量瓶中，用60%的色谱级乙醇溶解并定容。

1.2.2 酒样的测定

5 mL的酒样中加入0.1 mL 2%（v/v）的2-乙基丁酸，混匀，取约1 mL至样品瓶中，直接用于气相色谱分析。

吸取3 mL待测酒样，经0.22 μm滤膜过滤后取约1 mL至样品瓶中，直接用于液相色谱和液相色谱质谱联用分析。

1.2.3 定性与定量方法

气相色谱分析：通过TTMP标样测定的保留时间及标样组分直接添加来进行定性分析；通过在试样中添加内标溶液对待测组分进行定量分析。

液相色谱分析：通过TTMP标样测定的保留时间及标样组分直接添加来进行定性分析；通过外标法对待测组分进行定量分析。

液相色谱质谱联用分析：通过TTMP标样测定的保留时间及标样组分直接添加来进行定性分析；通过外标法对待测组分进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 白酒样品中TTMP气相色谱法检测条件的确定（图1）

图1 气相色谱法TTMP标准样品色谱图

气相色谱分析时，TTMP在乙酸后出峰，乙酸在酒中含量较高，在色谱图中峰展宽度较大。通过研究，发现载气流量、分流比、程序升温的起始温度及升温速率对二者的分离效果均产生极其重大的影响，尤其是程序升温速率。程序升温速率过慢，容易造成乙酸峰拖尾，TTMP分离效果不好；程序升温速率过快，则影响TTMP与其后的微量成分的分离，且易对色谱柱造成损害，缩短柱子的使用寿命。经过多次实验，确定了最优的色谱条件：进样量为1 μL；载气为氮气，流速为0.7 mL/min；分流比为20∶1；进样口温度为230℃；检测室温度为240℃；程序升温起始温度40℃，保持3.0 min，然后以15℃/min的升温速率升温至200℃，保持20.0 min。在此条件下，TTMP的分离状况，色谱的运行时间均为最佳。TTMP标样色谱图见图1，TTMP的保留时间为18.207 min。

2.2 白酒样品中TTMP液相色谱法检测条件的确定（图2）

图2 液相色谱法TTMP标准样品色谱图

查阅相关文献及对TTMP标样的全波长走读扫描发现，TTMP在278 nm处具有最大的特异吸收峰，从而确定其液相检测波长。对甲醇浓度、色谱柱温度及流速进行了优化，确定了白酒中TTMP检测的最佳色谱条件。当70%甲醇作为流动相时，目标峰的峰形较为对称，响应也较好，但保留时间过短，TTMP易受白酒中其他基质的影响，降低甲醇的浓度可使TTMP的保留时间延长，同时也会降低其响应。本研究经过多次实验，确定了流动相中甲醇的最佳浓度为35%。根据标样中TTMP的保留时间及在酒样中添加一定量的标准样品，对酒样中的TTMP进行了定性。TTMP标样色谱图如图2所示，TTMP的保留时间为16.401 min。

最佳色谱检测条件：流动相为甲醇∶水（v/v）=35∶65，流速为1 mL/min，柱温为35 ℃，色谱柱为phenomenex Gemini 5 μm C18110A(250×4.60 mm)，进样量为20 μL。白酒样品过0.22 μm滤膜后，直接进样。

2.3 白酒样品中TTMP液相色谱质谱联用法检测条件的确定（表1、图3）

表1 MRM检测参数表

图3 液质联用法TTMP标准样品色谱图

表2 3种方法的相对标准偏差(RSD)和回收率

液相色谱质谱联用法检测条件HPLC条件部分参考了2.2。基于ESI+对流动相的要求，在水相中加入0.1%甲酸，以利于TTMP的离子化，最终确定流动相组成为乙腈∶0.1%甲酸=35∶65，TTMP的响应值与分离度均较好，同时保留时间也较短；MS/MS方法参数部分，裂解电压(Fragmentor Voltage)主要影响毛细管末端进入MS1的母离子的丰度，碰撞能（Collision Energy）主要影响碰撞池中产生的子离子的丰度，通过对这两个参数的优化，最后确定的MRM参数见表1。该分析条件下TTMP标准样品的色谱图和质谱图见图3。

2.4 3种方法测定TTMP的精密度分析

在酒样中添加不同浓度的TTMP，3种方法分别进行测定，验证3种方法检测白酒中TTMP的回收率、精密度。气相色谱法检测白酒中TTMP的回收率为93.33%～98.44%，相对标准偏差RSD为5.39%～3.05%；液相色谱法检测白酒中TTMP的回收率为94.67%～100.33%，相对标准偏差RSD为4.00%～2.36%；液质联用法检测白酒中TTMP的回收率为95.33%～99.67%，相对标准偏差RSD为3.20%～1.76%（表2）。由上述数据可知，3种方法检测芝麻香型白酒中TTMP的重复性和精确度均较好，可以满足白酒厂日常检测分析的要求。

3 结论

建立了用气相色谱法、液相色谱法和液相色谱质谱联用法检测芝麻香型白酒中的健康功能因子TTMP的方法，并对3种方法检测TTMP的回收率和精密度进行了研究。回收率和相对标准偏差数据结果显示，3种方法测定芝麻香型白酒中TTMP的回收率和精密度均可以满足检验的要求。在日常检验工作中发现，利用气相色谱法测定芝麻香型白酒中的TTMP，随着进样数目的增多，柱效下降，芝麻香型白酒中的乙酸含量较高，造成乙酸在色谱图中峰展较宽，甚至拖尾，容易影响出峰顺序在其后的TTMP的分析测定。液相色谱法和液相色谱质谱联用法测定芝麻香型白酒中TTMP时，TTMP响应较高，出峰前后没有其他风味物质的干扰，定性定量更为准确。且样品无需前处理直接进样，操作简便，其中液相色谱法对仪器设备和技术人员的素质要求较低，更便于推广。但对于白酒生产工艺过程中基质较为复杂，且TTMP含量较低的曲粉、糟醅等样品，液相色谱质谱联用法具有检出限更低，灵敏度更高，假阳性低的优势，对生产工艺各阶段中TTMP的分析及生成机理研究具有重要意义。