高浓度酒精发酵技术研究进展

张 强

（长春理工大学生命科学技术学院，吉林长春130022)

20世纪90年代后期的20年间,世界酒精产量实现了稳步增长，其中燃料酒精尤为引人关注。出于能源及安全方面的考虑,世界各国都在努力发展燃料酒精项目,但目前燃料酒精生产成本较高，缺乏有效的市场竞争力，因此降低生产成本对于燃料酒精工业发展具有重要的意义[1]。

提高发酵液中的酒精浓度是目前酒精行业主要的创新方法。高浓度酒精发酵技术具有提高发酵终点酒精浓度，降低能耗，节约工艺用水及蒸汽用量，减少发酵周期等优势，可实现高细胞密度、高产物浓度和高速率发酵，从而有效降低酒精生产中的各项费用，因此高浓度酒精发酵技术一直是酒精行业及其相关机构重要的研究方向[2]。

主要介绍酒精工业目前存在的问题、高浓度酒精发酵概述以及影响高浓度酒精发酵的因素，对实现酒精高浓度发酵的措施进行综述。

1 我国酒精工业目前存在的问题

从能源危机及环境保护的角度来看，燃料酒精替代传统的化石燃料会成为必然，对燃料酒精的需求将会不断增长。目前我国酒精产量仅次于巴西和美国,居世界第3位，但与世界先进国家相比，我国酒精生产还存在一定的差距，主要表现在以下几方面。

1.1 发酵产物酒精浓度低

我国酒精生产企业最终酒精浓度在9%vol～11%vol，有的甚至还不到8%vol，与采用高浓度酒精发酵技术的先进国家相比,差距明显。采用高浓度酒精发酵技术，酒精浓度一般可达13%vol左右，有的甚至高达18%vol以上。

1.2 酒糟生产成本高

酒糟是酒精生产的副产物。国内酒精生产企业发酵液的酒精浓度为9%vol～11%vol，每生产1 t的11%vol酒精，将产生约10.5 t糟液，酒糟中干物质含量约为8%。而每生产1 t的16%vol酒精，仅产生约7.2 t糟液，酒糟中干物质含量可达13%左右。可见酒精浓度越高，酒糟干物质浓度也越高，酒糟生产成本也会降低。

1.3 酒精生产能耗高

酒精生产过程中蒸煮、蒸馏和酒糟生产等工段常常消耗大量的能耗。每吨酒精的电耗约89 kWh，蒸汽约3 t，水约1.0 t。采用高浓度酒精发酵技术可显著减少能耗，假如发酵液中酒精浓度增加1%，仅蒸馏工段就可以节约蒸汽约150 kg[3]。

2 高浓度酒精发酵技术

高浓度酒精发酵技术是提高发酵强度的重要措施，即在发酵罐体积不变的情况下,通过提高酒精浓度来提高酒精的产量。传统发酵中可溶固形物含量在20%～24%之间，而“高浓度发酵”中可溶固形物可达30%以上。随着发酵技术不断进步，高浓度酒精发酵中底物浓度有逐渐提高的趋势。

玉米是我国酒精生产的主要原料。根据淀粉水解以及葡萄糖酒精发酵反应式计算出不同酒精浓度下玉米粉用量,从而可以确定水与玉米粉调浆比例，具体结果见表1。

表1 不同酒精浓度下水与玉米粉的调浆比例

从表1可知，随着酒精浓度的增加，水与玉米粉的调浆比例发生明显变化。当酒精浓度为23%vol时，水与玉米粉的调浆比例接近1∶1。因此要想达到预期的酒精浓度，理论上必须达到最基本的水与玉米粉的混合比例[4]，因此高浓度酒精发酵具有较高的底物浓度，给酒精发酵会带来很大的影响。

3 影响高浓度酒精发酵的主要因素

酒精发酵是一个复杂的生化反应过程，高浓度酒精发酵具有较高的初始糖浓度和酒精浓度，会对酵母产生抑制作用，影响因素更为复杂。

3.1 还原糖代谢的影响

还原糖（主要指葡萄糖）是酵母菌发酵生产酒精的主要营养物，但高浓度葡萄糖对酶的生物合成以及菌体生长都有不利影响。发酵初期，通常细胞所受糖的抑制作用大于酒精的作用，如何消除高浓度葡萄糖对酵母菌的抑制作用尤为重要[5]。

3.2 氮源及其他营养物质的影响

高浓度酒精发酵过程中，添加适宜的氮源和其他营养物质，才能保证酵母菌生长以及抵抗高渗透压的影响。如果缺乏这些物质，会引起菌体生长代谢缓慢,发酵周期延长。

3.3 高浓度酒精的影响

一般来讲，发酵液中酒精含量超过23%vol时，酵母菌细胞就会死亡。高浓度酒精主要影响细胞形态和生理活性。细胞形态变化会导致细胞骨架变得疏散，细胞生理活性变化会导致生物大分子的合成与代谢受阻等。

3.4 溶氧的影响

氧气一方面可以促进细胞生长，有效帮助酵母细胞抵抗高浓度酒精的毒害，另外还可以促进不饱和脂肪酸和类脂质等存活因子的合成。高浓度酒精发酵过程中由于料液黏稠，导致氧传递困难，因此高浓度酒精发酵过程中应保证溶氧的充分供给。

4 实现高浓度酒精发酵的主要措施

4.1 酿酒酵母改造

发酵过程中，随着发酵液酒精浓度增加,酒精对酵母毒性增大。研究表明，通过自然选育、原生质体融合、诱变育种、基因重组，固定化等技术手段可提高酵母的耐受性，实现高浓度酒精发酵。

杜鹃等[6]以东北椴树蜜为原料，通过分离纯化得到1株酿酒酵母YMI-37，该菌株能在葡萄糖含量80%的环境中生长，酒精产量高而且发酵速度快。吴华昌等[7]从白酒窖池的酒糟中经过富集培养筛选出1株能产生18%vol酒精的酵母菌株。

通过紫外线照射引起基因突变，然后再对各种突变品系进行筛选，是诱变育种技术常用手段。彭源德等[8]通过紫外诱变育种，获得了1株能耐受16%vol酒精浓度的酵母菌株，当培养基中酒精含量为20%vol时，耐酒精能力比对照高31%左右。赵硕等[9]采用紫外诱变进行耐高糖酵母菌株的筛选，采用15 W紫外灯，照射40 s，成功获得2株在65%的高糖环境下仍能发酵的菌株。

诱变育种与原生质体融合技术相结合是获得高产菌株常规而有效的手段。徐琳[10]对实验室的酵母菌进行紫外线诱变和杂交处理,选育出酵母菌J-l-l-3，利用该菌株发酵，酒精浓度能达到14.1%vol。王滨等[11]利用筛选出的酵母菌，经紫外线诱变原生质体，选育出酒精高产菌株Y316-23，发酵液中酒精浓度达到13.5%vol以上。

通过基因重组技术获得的菌株往往具有较高的生产潜能。Shi等[12]对酿酒酵母SM-3采用基因重组技术获得了1株突变株F34，该菌株在45～48℃、20%葡萄糖培养基中可产生9.9%vol酒精,远高于出发菌株。

采用固定化酵母进行酒精高浓度发酵，可大大提高酒精产率。伍彦华等[13]采用自絮凝酵母FJY进行酒精发酵，发现该菌株具有较高的耐渗透压，产酒精能力强，最终酒精浓度达到15.7%vol。通过提高温度也能增加酵母的产酒率。陆雁等[14]筛选到1株产酒率高、温度耐受性好的酵母菌株，当料水比为1∶2，发酵64 h后，酒精浓度达到15.5%vol。

河南天冠股份公司采用无糖化工艺，控制酒母培养温度、接种量及发酵装醪梯度，发酵酒度由13.0%vol提高到 14.0%vol，最高达到 15.97%vol，使木薯酒精生产迈入浓醪发酵模式，每年可多产无水酒精9669.6 t，大大提高了经济效益。

4.2 添加酶制剂

酶制剂在高浓度酒精发酵过程中发挥着重要作用，常用的酶有蛋白酶、糖化酶以及木聚糖酶等。

研究表明，发酵液中游离氨基氮浓度低于100mg/L时，酵母菌的生长受到抑制，在150～870 mg/L范围内，游离氨基氮浓度与酒精发酵速度是有直接关系的，游离氨基氮浓度越高，发酵速度越快。生产酒精常用的原料玉米、小麦中虽然含有大量的粗蛋白，但液化液中通常含游离氨基氮浓度只有约80 mg/L，而且酵母菌本身并不含蛋白酶，它不能分解或使用超过3个肽键以上的蛋白质，所以额外补充氨离子含量、自由氨基氮是非常重要的。蛋白酶水解蛋白质生成大量自由氨基氮物质，能够促进酵母生长与繁殖，也可促进未完全水解的淀粉和蛋白质的分离，从而降低发酵液的黏度。黄河[15]在玉米高浓度酒精发酵过程中，酸性蛋白酶的添加量为20 U/g玉米，酒精浓度达到14.8%vol。王晨霞等[16]在酒精高浓度发酵中添加酸性蛋白酶，在起始总糖为28.2%的情况下，酒精度达到15.9%vol。韩颖[17]利用脱胚玉米为原料，采用多酶协同糖化发酵工艺，通过添加酸性蛋白酶和木聚糖酶，发酵酒精浓度达到14.2%vol。郑丽蔓[18]使用玉米粉为原料，料水比为1∶1.8，发酵过程中加入蛋白酶,经过60 h的发酵，发酵成熟醪中酒精度达到16.5%vol左右，实现了高浓度酒精发酵。

糖化酶的作用是把溶解状态的淀粉、糊精转化为能够被酵母利用的可发酵性物质，降低醪液的黏度，有利于酵母的发酵和酵液的输送。马文超等[19]利用筛选的糖化酶作为糖化剂，进行玉米发酵酒精试验，糖化酶的最适添加量为100 U/g原料，料水比1∶2，30 ℃条件下恒温发酵60～70 h，发酵醪酒精度达15%vol。池振明等[20]利用国内常用的糖化酶制剂糖化生玉米面中的淀粉，同时接种高浓度酒精酵母菌HO，这株酵母菌在70 h内可产生17.5%vol的酒精。

4.3 添加营养物质

大量研究发现，在培养基中加入适量的营养物质，如海藻糖、脂肪酸以及肌醇等，都可以有效提高酵母菌耐酒精能力，实现高浓度酒精发酵。

海藻糖在酵母中含量较高，是酵母的生存保护剂，酵母在胁迫环境下所表现出的耐受力与体内海藻糖含量有直接的关系。李绩等[21]对11株酵母菌进行了渗透压、酒精耐性实验，发现渗透压耐性和酒精耐性较好的菌株，其积累海藻糖的能力较强。陈丽君等[22]探讨了酿酒酵母对不良环境的耐受性影响，表明细胞内海藻糖含量与酵母耐受性之间具有一定的相关性，海藻糖含量越高，酵母的耐性越好。Siraje等[23]研究了高浓度酒精条件下海藻糖对酿酒酵母的作用，结果表明，高度累积的海藻糖可使酵母细胞具有较强抗性。

肌醇是磷脂的重要组分之一，而磷脂是细胞膜的最重要成分，所以肌醇在酵母耐酒精能力方面起着重要的作用。季冉等[24]在培养基中加入肌醇，发现随肌醇浓度的增加,酒精的生成量呈上升趋势，结果见表2。表明肌醇能够对细胞起保护作用,免受高浓度酒精毒害。

表2 肌醇对酵母发酵耐酒精能力的影响

麦角甾醇是酵母细胞膜脂质的重要组成成分，能提高膜的液化和缩合，对膜发挥调节作用，因此与酒精耐性密切相关。Inoue等[25]研究发现，在培养基中添加一定量的麦角甾醇可以促进酵母生长，提高酵母酒精产量及其酒精耐性。饱和脂肪酸（例如棕榈酸、硬脂酸）和不饱和脂肪酸（例如油酸）都可以通过增强细胞膜渗透屏障来提高菌体的耐酒精能力。邢建宇等[26]研究发现，在对酿酒酵母酒精耐受性的影响方面，油酸的作用更为明显。在酒精发酵方面，硬脂酸的影响更为明显，其中添加硬脂酸酒精产率最高，为8.7%vol。甘氨酸和脯氨酸也可以直接或间接地作为细胞渗透压保护剂。薛颖敏等[27]对酿酒酵母X330耐酒精性能进行了研究，发现甘氨酸和脯氨酸作为渗透压保护剂能有效提高菌体酒精耐受性能，甘氨酸的促进作用强于脯氨酸。

因此高浓度酒精发酵时，添加适当的营养物质，不仅可以提供营养，而且能够保护细胞免受胁迫伤害的作用，提高酒精产量。

4.4 其他方面

发酵设备及工艺改造：通过改进发酵罐的机械搅拌与通风装置，以提高质量、热量、动量的传递性能。应增加通风设备，提高供氧能力等。发酵工艺方面，由于高浓度酒精发酵中醪液浓度高会造成物料输送不畅以及发酵残糖过高，所以原料可以采用颗粒粉，粉碎粒度直径约3 mm，以降低料液黏度，这样醪液中有“浓”有“稀”，效果比细粉好。另外，为减少发酵过程中的底物抑制作用，可以采用无糖化工艺或同步糖化发酵模式。

产品分离耦合工艺：在发酵过程中，可以采用真空发酵法、膜分离发酵法以及萃取发酵法等分离耦合技术将酒精不断分离除去，从而有效解除酒精抑制作用，提高发酵速度和发酵强度。目前产品分离耦合的方法是生物工程领域重要的研究课题。

5 结论

高浓度酒精发酵是具有重大应用价值的前瞻性技术,对提高企业效益、节约能源有积极的促进作用。虽然酒精高浓度发酵技术目前取得了较大进展，但仍存在很多技术障碍，如高浓度物料输送、高浓度底物以及酒精对酵母的抑制作用等问题。但酵母仍是高浓度酒精发酵的主体，如何提高酵母高耐性和发酵能力，还需后续更多的去研究，以便为未来高浓度酒精规模化生产提供成熟的技术支持。