基因突变检测及二代测序在急性髓系白血病预后分析中的应用

李世青 王刚

【摘 要】

影响急性髓系白血病（Acute Myelocytic Leukemia，AML）预后的主要因素包括细胞遗传学、分子生物学等，同时近年来二代基因测序技术快速发展并逐渐应用于AML诊断及预后分析，因此本文介绍了二代测序的发展历程以及从单基因检测、双或多基因联合检测两方面对AML预后分析进行综述。

【关键词】急性髓系白血病；基因突变；预后；二代测序

【中图分类号】 R365

【文献标识码】 A

【文章编号】 1672-3783（2019）02-03-001-01

急性髓系白血病（Acute Myelocytic Leukemia，AML）是一类髓细胞系起源的白血病细胞在血液、骨髓和其他组织中克隆性增殖的白血病。由于染色体异常以及基因突变等分子遗传学或表观遗传学的异常，导致正常的造血系统在定向髓系分化的过程中，在不同阶段发生恶变而引发血细胞分化的阻滞，形成不同亚型的血液系统疾病。对AML预后的分析，主要集中在细胞遗传学染色体核型分析以及分子生物学基因检测。运用二代测序能够很好地分析具有预后意义的基因突变，为预后分层系统及个体化治疗奠定一定的基础。

1 AML预后影响因素

影响AML预后的因素主要有年龄、性别、初诊时白细胞计数、白细胞分化阶段以及有无先前的血液学疾病等一般情况，以及细胞遗传学、分子学异常。而近年来发现，通过染色体核型评估预后满足不了临床需要。分子学异常研究是指基因突变分析，主要包括FLT3、NPM1、NMT3A、C-KIT、CEBPA、IDH1/2等AML患者中出现频率较高的体细胞突变[1]。同时单基因突变分析仍不足以将占比60%以上的中危核型AML（Intermediate-risk AML，IR-AML）很好地进行预后分层，需纳入新的基因及多基因突变组合来进一步分层。

2 二代测序技术

人类在2004年使用Sanger一代测序技术，完成了人类基因组的测序计划，虽然该结果具有划时代意义，但耗时和高成本限制了其广泛的应用。由于一代測序的相对不足以及临床及科研需要，二代测序技术应运而生。新一代测序技术（Next generation sequencing， NGS）具有高通量性、快速性、准确性、费用低和信息量丰富等优点，研究者可以在短时间内对基因进行精确定位和分析。目前二代测序的主要技术平台代表有罗氏公司（Roche）的454测序仪（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。同时二代测序技术包括全基因组测序、外显子测序及转录组测序等。二代外显子测序主要用于AML的预后分析，根据现有的基因杂交芯片，高效且敏感检测多个基因突变，从而明确诊断和评估AML的预后，指导AML治疗。

3 单基因突变分析与预后

3.1 FLT3基因突变与预后

FLT3突变发生于近30%的AML，在AML中有两种常见形式：一种是内部串联重复突变（FLT3-internal tandem duplication，FLT3-ITD），是正常核型AML（Cytogenetically Normal AML， CN-AML）中最常见的一种突变类型；另一种是累及激酶区活化环内的点突变 （FLT3 tryrosine kinase domain mutation，FLT3-TKD），其最常见于835位天冬氨酸及836位异亮氨酸的突变。除了研究突变存在与否，马亮等应用Illumina的Miseq二代测序仪对23例FLT3-ITD阳性AML患者FLT3基因序列进行分析，共检测到的33条ITD中，17条ITD插入序列为FLT3野生型完全重复，16条ITD为野生型部分重复，指出FLT3-ITD序列特征变化较大但突变热点区域较为集中于p.Y572位至p.L602位之间[2]。FLT3-TKD突变在AML中发生率为5%～14%。目前FLT3-TKD突变对预后的影响尚无一致定论。

3.2 NPM1基因突变与预后

NPM1基因定位于染色体5q35，编码核磷蛋白NPM主要定位于核仁区，野生型NPM主要对核糖体RNA进行加工、控制中心体的复制、维持基因组的稳定。NPM1基因突变后，NPM蛋白C端的氨基酸序列发生改变，NPM就会在细胞质中异常堆积。NPM1突变细胞往往表现为CD34和CD133缺失或低表达，而CD33分子高表达[3]。

3.3 DNMT3A基因突变与预后

DNMT（DNA甲基化转移酶）是基因DNA甲基化的关键酶，主要类型有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。近年研究发现，DNMT3A与AML密切相关。DNMT3A基因突变存在于14%～36%的AML患者，在FAB分型M4、M5型患者中突变率更高，并与高龄、高白细胞计数、高血小板计数呈正相关。其突变类型R882的错义突变最为常见，常见突变有R882H、R882C等。Ley TJ等的研究表明，存在DNMT3A突变的患者较不存在DNMT3A突变的患者有较短的总体生存率（OS）[4]。Marcucci等的研究结论进一步指出，在CN-AML患者中，年轻（< 60岁）的非R882位点突变患者无病生存期（DFS）、OS缩短，而老年（≥ 60岁）患者存在R882位点突变时才有相同的结果[5]。

3.4 C-KIT基因突变与预后

C-KIT（CD117）是一种原癌基因，位于人染色体4q12-13，是酪氨酸激酶受体蛋白家族的重要成员之一，C-KIT基因突变与急性白血病中的发病、治疗和预后等密切相关。丁子轩等用基因测序方法对656例中国AML患者中C-KIT、NPM1、FLT3基因进行检测并进行分析，发现t（8；21）/M2患者常伴有C-KIT的17号外显子突变；inv（16）/M4患者常伴有C-KIT的8号外显子突变[6]。

3.5 IDH基因突变与预后

IDH属于DNA甲基化修饰基因，包括IDH1和IDH2两种基因，分别位于2号和15号染色体。

IDH1突变率为4 %～14%，很少出现IDH1与IDH2共表达，突变类型多为R132位点突变。

IDH2突变率在AML患者中为3 %～19%，常与高龄、高中危血小板计数相关，其突变位点多在R140，其次是R172，易发生在AML-M5患者中，易表达CD34和CD13。R140突变的年轻AML患者预后良好，OS延长[7]。IDH1和IDH2突变对AML预后的意义还需进一步的研究证实。

4 多基因突变检测与预后

4.1 FLT3-ITD突变与NPM1突变、DNMT3A突变

FLT3-ITD突变与NPM1突变密切相关，NPM1突变阳性的AML患者 FLT3-ITD的突变检出率远高于NPM1突变阴性的AML，而伴FLT3-ITD突变 AML M3患者中NPM1突变的检出率亦高达60%。FLT3-ITD（-）/NPM1（+）的AML患者对诱导化疗反应最好，完全缓解率（CR）最高，若存在FLT3-ITD突变，无论NPM1是否突变，AML患者的CR都会降低。

研究发现，FLT3-ITD、NPM1和DNMT3A突变往往共存發生，因此其预后意义也需要联合进行分析。Hou HA等对506个AML患者的研究发现，DNMT3A的不良预后意义仅在伴NPM1（+）/FLT3-ITD（+）或NPM1（-）/FLT3-ITD（+）或NPM1（-）/FLT3-ITD（-）的情况下才能凸显出来，而在伴发有利基因型 NPM1（+）/FLT3-ITD（-）时则显示不出其不良预后[8]。国内有研究指出，对95例中危AML患者进行常见基因突变分析，发现5例患者同时出现FLT3-ITD、NPM1和DNMT3A基因突变，分析指出5例患者化疗后均未缓解，并均在6个月内死亡[9]。

4.2 NPM1和IDH1/2同时突变伴FLT3-ITD阴性

IDH1突变很少与FLT3-ITD共表达，但出现FLT3-ITD突变时，累积复发率降低，为预后良好因素，而ITD阴性患者则相反，不过这限制在年轻的AML（非M3）患者中。对于年轻AML（非M3）患者，当FLT3-ITD（-）/NPM1（+）时，IDH2 R140突变患者的复发率比细胞遗传学低危组低；而伴NPM1阴性时，IDH2 R172突变患者复发率与高危组相似[10]。

4.3 CEBPA双突变/CEBPA单突变与其他基因突变

研究指出，CEBPA单突变相对CEBPA双突变来说，更易伴发基因突变。进一步对伴发突变基因测序分析，表明CEBPA单突变更易伴发DNMT3A、IDH1、IDH2等DNA甲基化修饰基因突变，也会伴发具有不良突变意义的基因DNMT3A、FLT3-ITD、TP53的突变，这可能是CEBPA单突变与CEBPA双突变对预后影响不一致的原因[11]。

5 总结

基因突变检测对AML的预后评估具有重要意义。近年来，FLT3-ITD、DNMT3A、C-KIT、CEBPA、NPM1基因突变对AML预后评估的研究基本明确，IDH等基因突变对预后的影响还需进一步研究证实。同时越来越多的基因突变被发现影响AML预后，单基因检测已经远不能满足临床需求，通过二代测序技术的应用对新基因突变的发现以及将不同基因突变组合对预后进行分层，为AML个体化治疗方案奠定基础。

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