无刺蜂蜂胶乙醇提取物的体外抗氧化及抗炎活性

王蓓，常化松，苏松坤，孙丽萍，王凯



无刺蜂蜂胶乙醇提取物的体外抗氧化及抗炎活性

王蓓1,2，常化松2，苏松坤1，孙丽萍2，王凯2

（1福建农林大学蜂学学院，福州 350002；2中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093）

【目的】无刺蜂(stingless bees)是热带和亚热带地区重要的授粉昆虫之一，以尾部无蛰针为典型特征，其蜂胶采集量较意大利蜜蜂（）更多，然而其蜂胶活性研究却相对匮乏。本文以来源于马来西亚无刺蜂 ()采集蜂胶的乙醇提取物(ethanol extract ofpropolis, EEHI)为研究对象，旨在探究其体外抗氧化和抗炎活性。【方法】采用福林酚法和硝酸铝法测定EEHI中总酚酸和总黄酮含量，并采用DPPH和ABTS+·自由基清除能力评价EEHI的体外抗氧化能力；在此基础上，采用细菌脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7炎症模型，通过CCK-8法检测EEHI对细胞相对存活率的影响，在保证EEHI对细胞无细胞毒性作用基础上，分别采用Griess法和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术评估EEHI对LPS诱导的RAW 264.7细胞中炎症介质一氧化氮（NO）释放量的影响以及其对炎症因子（、和）和抗氧化基因（）信使RNA表达的影响；进一步利用免疫印迹和免疫荧光方法，以NF-κB炎症信号通路为切入点，研究EEHI对LPS诱导巨噬细胞中p-IκΒ和IκΒ蛋白表达以及NF-κB-p65蛋白移位的影响，从而探究EEHI潜在的抗炎机理。【结果】EEHI中总酚酸和总黄酮含量分别为54.70 mg GAE·g-1和116.20 mg QE·g-1；DPPH和ABTS+·自由基清除能力IC50值分别为275.60和 284.00μg·mL-1。EEHI对RAW 264.7细胞的安全浓度为0—40 μg·mL-1。在LPS诱导的Raw 264.7细胞炎症模型中，相对于LPS刺激组，0—40 μg·mL-1的EEHI以浓度依赖方式显著地抑制了LPS诱导的RAW 264.7细胞中NO的释放量，且降低了细胞中炎症因子、和的基因表达量，并增强了抗氧化基因的表达。进一步研究发现，0—40 μg·mL-1的EEHI以浓度依赖方式显著抑制了LPS诱导的RAW 264.7细胞IκΒ蛋白的磷酸化，且40 μg·mL-1的EEHI显著降低了NF-κB-p65蛋白的核移位现象，因此推测EEHI可能是通过抑制LPS诱导的NF-κB信号通路的激活进而发挥了体外抗炎活性。【结论】无刺蜂蜂胶乙醇提取物中含有大量多酚类化合物，具有较好的抗炎和抗氧化效果，极具开发利用价值。

无刺蜂; 无刺蜂蜂胶；抗氧化；抗炎；NF-κB

0 引言

【研究意义】无刺蜂（stingless bees）是热带和亚热带地区重要的授粉昆虫之一，其区别于意大利蜜蜂（）的主要特征是尾部无蛰针[1]。无刺蜂蜂种繁多，是最具有代表性的一种，该种无刺蜂主要分布于热带和亚热带雨林气候地区，其蜂胶年产量远大于意大利蜜蜂，且胶源植物来源广泛，生物学活性多样，具有很高的生产价值和发展空间[2-3]。明确无刺蜂蜂胶（geopropolis）的体外抗氧化和抗炎效果，对进一步研究其生物学活性及特色蜂产品开发具有重要意义。【前人研究进展】无刺蜂蜂胶是由无刺蜂采集植物树脂并混合蜂蜡以及泥土等制成的具有不同颜色的固体胶状物，其在蜂箱中主要用来筑巢、填补蜂箱缝隙以及防御病虫害入侵[1]。无刺蜂蜂胶作为一种民间药物，在热带地区一直用于修复伤口，治疗消化、呼吸、皮肤疾病，并用作抗菌剂和防腐剂等[4-5]，具有丰富的药理学活性，如抗炎[6]、抗氧化[4]、抑菌[7]、抗癌[8]、抗病毒[9]、镇痛[1]等。无刺蜂蜂胶主要含有苯丙酯类、黄酮类、酚酸类、可水解鞣质、三萜类、皂苷类以及生物碱类化合物，其中酚酸类、黄酮类和萜烯类化合物是其主要成分[10]。通过薄层色谱分析发现，蜂胶甲醇提取物中含有萜烯类、黄酮类、酚酸类、类固醇、皂角苷和香豆素类化合物[8,11]。笔者课题组前期通过UHPLC-Q-TOF/MS联用技术分析蜂胶乙醇提取物，发现含有没食子酸、咖啡酸、香草酸、苯甲酸、短叶松素、山奈酚、倒捻子素等多种酚酸、黄酮类和丰富的萜烯类化合物[12]。近年来，大量研究证明意大利蜜蜂蜂胶（主要是中国杨树型蜂胶、巴西酒神菊属型蜂胶）的抗氧化、抗炎活性与蜂胶中的酚酸类和黄酮类化合物密切相关，如山奈酚、咖啡酸苯乙酯、槲皮素、阿替匹林-C等[13]。炎症是机体在受到外界刺激下引起的一系列免疫应激反应，通过调节相关的炎症介质和细胞因子能够有效地缓解炎症反应，如、、等[14]。进一步研究证明蜂胶中的活性物质主要通过调节花生四烯酸代谢、L-精氨酸、抑制NF-κB等炎症相关信号通路实现其抗炎活性，其中核转录因子NF-κB是巨噬细胞炎症过程主要的信号通路，NF-κB被激活会造成促炎因子高表达[13,15]。笔者课题组前期研究发现富含多酚的中国蜂胶能够通过调节炎症相关因子（、、等）的表达，抑制脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞IκΒα蛋白的磷酸化进而抑制NF-κB-p65入核，缓解脂多糖诱导的急性炎症反应[15]。Franchin等[16]研究发现，蜂胶的正己烷和水溶性组分能够通过调节和炎症因子从而缓解机械性炎症过敏。此外，从无刺蜂蜂胶中分离得到的香豆素类单体成分Cinnamoyloxy-mammeisin（CNM）能够降低肽聚糖诱导的巨噬细胞炎症反应中ERK-1/2、JNK、p38 MAPK和AP-1等蛋白的磷酸化，并且抑制NF-κB信号通路的激活从而减缓巨噬细胞的炎症反应[17]。【本研究切入点】蜂胶具有抗氧化、NO清除能力、抗糖尿病和抑菌等生物学活性[6,10]，但与其抗炎和抗氧化相关的分子机制研究未见报道。【拟解决的关键问题】通过体外自由基清除能力评估蜂胶乙醇提取物（ethanol extract ofpropolis，EEHI）的抗氧化活性，分析EEHI对RAW 264.7小鼠巨噬细胞增殖活力及NO释放量的影响，并测定EEHI对脂多糖诱导的细胞炎症因子和抗氧化基因在mRNA转录水平表达的影响，通过进一步的免疫印迹和免疫荧光技术探究EEHI对NF-κB信号通路的影响。

1 材料与方法

试验于2017年11月至2018年6月份在中国农业科学院蜜蜂研究所蜂产品研究室完成。

1.1 供试材料、试剂与仪器

蜂胶样品于2017年10月采集于马来西亚沙捞越州诗巫市常青蜂场，-20℃冰箱储存。

CCK-8试剂盒（Dojindo，日本）；LPS（脂多糖）（Sigma-Aldrich，美国）；DMEM高糖培养基，FBS（Gibco Laboratories，美国）；青链霉素混合液（100×）（索莱宝生物科技有限公司，中国）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二铵盐）自由基（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulphonate) radical，ABTS+·）（Sigma-Aldrich，美国）；PCR引物，Prime ScriptTMRT Master Mix试剂盒，TB Green ®Premix Ex TaqTM（生工生物（上海）股份有限公司），异硫氰酸胍，BSA（Sigma-Aldrich，美国）；特异性抗体：IkappaB-alpha（Iκ-Β）（Cell signaling technology，美国），phosphor-IkappaB-alpha（P-IκΒ）（Cell signaling technology，美国），-actin购自Abcam公司（Cambridge，美国）；NF-κB-p65（Cell signaling technology，美国）；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色剂（碧云天，中国）；一抗稀释液、二抗稀释液（武汉赛博生物科技有限公司，中国）。

SpectraMax®i3酶标仪（美谷分子仪器有限公司，中国）；NanoDrop 2000超微量分光光度计（赛默飞世尔科技有限公司，美国）；PCR仪（东胜创新生物科技有限公司，中国）；荧光定量PCR仪（杭州博中科技有限公司，中国）；激光共聚焦扫描显微镜（Leica，德国）。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理 称取25 g粉碎的蜂胶样品，按物料比1﹕15加入100%无水乙醇，40℃超声3 h，过夜静置后取上清，重复3次。混合3次上清浸提液减压旋蒸至恒重，-20℃储存。

1.2.2 总酚酸和总黄酮含量的测定 EEHI中总酚酸的含量检测采用福林酚法[18]。取一定浓度的EEHI样品溶液150 µL于1.5 mL离心管中，同时加入等体积的福林酚试剂，振荡混匀后室温避光反应5 min，然后加入450 µL 2%（W/V）的碳酸钠溶液，摇匀后室温避光反应2 h，取200 µL的反应试剂加入96孔板中，设置2个副孔，同时设置样品空白对照，于=765 nm处测吸光值。以没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）为标准，计算EEHI中总酚酸的含量。

EEHI中总黄酮的含量的测定采用硝酸铝法[18]。取一定浓度的EEHI样品溶液300 µL于1.5 mL离心管中，同时加入硝酸铝（100 g·L-1）溶液和醋酸钾（9.8 g·L-1）溶液各20 µL，振荡混匀后加入660 µL的蒸馏水，摇匀后室温避光，静置反应1 h后，取200 µL加入96孔板中，设置2个副孔，同时设置样品空白对照，于=415 nm 处测吸光值。以槲皮素（quercetin equivalent，QE）为标准，计算EEHI中总黄酮的含量。

1.2.3 自由基清除能力测定 EEHI的ABTS+·自由基清除能力参考Yang等[18]方法并适当调整。于1.5 mL离心管中加入250 µL ABTS+·工作液和150 µL样品，振荡均匀后避光反应10 min。取150 µL反应液加入96孔板，于=734 nm波长处测定吸光度，记为A1，同时做样品空白A2和试剂空白A0。每组样品同时设置3个平行值。以试样质量浓度和清除率计算线性回归方程，并计算其半抑制浓度。EEHI样品的ABTS+·自由基清除能力用IC50表示。计算公式：清除率（%）=[1-(A1-A0)/A2]×100。式中，A1为样品上清液吸光值，A0为试剂空白组吸光值，A2为样品空白组吸光值。

EEHI的DPPH自由基清除能力采用Yang等[18]方法并适当调整。于1.5 mL离心管中加入125 µL DDPH工作液和125 µL样品，振荡均匀后避光反应30 min。取100 µL反应液加入96孔板，于=517 nm波长处测定吸光度，记为A1，同时做样品空白A2和试剂空白A0。每组样品同时设置3个平行值。以试样质量浓度和清除率计算其线性回归方程，并计算其半抑制浓度。EEHI样品的DDPH自由基清除能力用IC50表示，清除率计算公式同上。

1.2.4 抗炎活性测定 细胞培养及细胞活力测定：RAW 264.7小鼠巨噬细胞系由浙江大学胡福良教授惠赠。用含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液（100×）的DMEM高糖培养基培养小鼠巨噬细胞RAW 264.7，37℃、5% CO2培养箱孵育，1 d传代一次。将1.5×105个/mL小鼠巨噬细胞RAW 264.7均匀接种于96孔板中，待细胞长到70% 左右，加入不同浓度的EEHI。处理24 h后，每孔加入10 µL CCK-8反应2 h后，于=450 nm处检测吸光值，以样品空白组为对照计算细胞相对存活率。

Griess法测定样品对细胞中NO含量的影响：将1.5×105个/mL小鼠巨噬细胞RAW 264.7均匀接种于24孔板中，待细胞长到70%左右，加入不同浓度的EEHI孵育1 h后，加入终浓度为1 µg·mL-1脂多糖诱导细胞炎症反应，继续孵育24 h。收集细胞培养液，5 000 r/min离心10 min，取上清，与等体积Griess A试剂混合均匀后，取100 µL反应液于96孔板中并加入50 µL Griess B，避免气泡产生，摇匀，于=540 nm处检测吸光值。根据NO2-标准曲线计算NO的含量。

样品对细胞中相关炎症因子在mRNA水平表达影响的检测：将1.5×105个/mL RAW 264.7细胞均匀接种于24孔板中，待细胞长到70%左右，加入不同浓度的EEHI孵育1 h，而后加入终浓度为1 µg·mL-1脂多糖，孵育6 h。采用CarryHelix RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，采用NanoDrop 2000超微量分光光度计测所提取样品RNA 的浓度和纯度，使用PrimeScriptTMRT Master Mix反转录试剂盒，以1000 ng总RNA反转录合成cDNA模板，反转录产物置于-20℃待用。实时荧光定量PCR采用TB Green ®Premix Ex TaqTM试剂盒进行，引物序列如表1所示。反应体系（总体积10 µL）：TB Green ®Premix Ex TaqTM5.0 µL，上游引物0.2 µL，下游引物0.2 µL，cDNA模板0.2 µL，RNase Free dH2O 4.4 µL。

表1 实时荧光定量PCR相关引物序列

免疫印迹（Western blot）：将1.5×105个/mL RAW 264.7细胞均匀接种于6孔板中，待细胞生长至90%融合度，经不同浓度的EEHI孵育1 h，加入终浓度为1 µg·mL-1的脂多糖，于37℃，5% CO2培养箱孵育0.5 h后，用含酶抑制剂的NP-40蛋白裂解液收集提取蛋白样品，然后采用BCA测定样品蛋白浓度，按照20 µg的蛋白总上样量对各组细胞样本蛋白进行免疫印迹检测，经过12%的SDS-PAGE凝胶电泳、转印、杂交、碱性磷酸酶显色等步骤，得到IκΒ、p-IκΒ和-actin的杂交条带。

NF-κB-p65的免疫荧光定位：将处于对数生长期的细胞按9×104个/mL接种到爬片共聚焦小皿中，37℃，5% CO2培养箱过夜孵育，预处理40 μg·mL-1的EEHI 1 h，加入终浓度为1 μg·mL-1的脂多糖0.5 h后，用固定液（甲醇﹕丙酮=1﹕1）固定0.5 h，0.5%的Triton X-100透化0.5 h，10%血清封闭液室温封闭0.5 h，加入1﹕50的一抗（NF-κB-p65）稀释液和1﹕500的二抗羊抗兔（IgG）稀释液分别孵育1 h，DAPI（1﹕2 000稀释）染核处理封片，激光共聚焦扫描显微镜观察，并分析结果。

1.3 数据处理与分析

试验结果均以平均值±标准差（mean±SD）表示，数据采用SPSS软件进行ANOVA分析，Graphpad Prism 5.0作图。＜0.05表示差异显著，＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 总酚酸和总黄酮的含量及体外自由基清除能力

由表2可知，EEHI的总酚酸含量为54.70 mg GAE·g-1，总黄酮含量为116.20 mg QE·g-1。EEHI抑制50% DPPH和ABTS+·自由基的浓度分别为275.60和284.00 μg·mL-1。

表2 EEHI总酚酸和总黄酮的含量及体外自由基清除能力

2.2 EEHI对巨噬细胞RAW 264.7细胞活力的影响

为保证EEHI对细胞的代谢生长无明显的毒性，采用CCK-8法检测0—50 μg·mL-1的EEHI对小鼠巨噬细胞 RAW 264.7细胞相对增殖活力的影响，结果如图1所示。与对照组相比，RAW 264.7细胞经过不同浓度EEHI处理后，0—40 μg·mL-1的EEHI对细胞生长无显著抑制效果，而50 μg·mL-1的EEHI对细胞的生长有显著的抑制作用。因此，40 μg·mL-1为EEHI的安全浓度上限。

2.3 EEHI对小鼠巨噬细胞RAW 264.7中NO释放量的影响

通过典型的Greiss法检测不同浓度EEHI对脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应模型中NO释放量降低的效果。如图2所示，RAW 264.7细胞单独经过脂多糖刺激后，NO含量相对于对照组明显升高。在经过EEHI孵育后再加入脂多糖刺激与脂多糖组相比，NO释放量呈极显著下降趋势，且具有浓度依赖性。因此，EEHI能够抑制炎症过程中NO含量的产生，从而缓解炎症反应。

**：P＜0.01

***：P＜0.001

2.4 EEHI对巨噬细胞 RAW 264.7炎症相关因子表达的影响

RT-qPCR结果表明，EEHI能够极显著地抑制脂多糖诱导的、和等基因的表达，其中EEHI对、表达的抑制作用与浓度相关。此外，EEHI在10 μg·mL-1时能够显著促进表达，在20—50 μg·mL-1时能极显著增加表达（图3）。因此，在安全浓度范围以内，EEHI具有良好的抗氧化和抗炎能力。

A：诱导型一氧化氮合酶INOS；B：白介素-10 IL-10；C：白介素-1β IL-1β；D：血红素氧合酶1 HO-1。*：P＜0.05；***：P＜0.001

2.5 EEHI对脂多糖诱导的IκΒα活化的抑制作用

采用Western blot方法检测细菌脂多糖诱导的巨噬细胞中IκΒ和磷酸化IκΒ的蛋白相对表达水平，结果发现脂多糖刺激组IκΒ的磷酸化明显增加，而经过不同浓度EEHI孵育后处理组IκΒ的磷酸化水平被抑制，且随着EEHI浓度的增加，p-IκΒ显著降低（图4）。

2.6 EEHI对巨噬细胞p65(NF-κB)核定位的影响

为进一步探究EEHI对NF-κB激活的抑制作用，采用激光共聚焦扫描显微镜观察40 μg·mL-1的EEHI对脂多糖诱导的炎症信号通路NF-κB-p65入核定位的影响，结果表明脂多糖刺激组显著激活了NF-κB-p65入核，而经过40 μg·mL-1的EEHI预处理后，NF-κB-p65入核受到了明显的抑制（图5）。

图4 不同浓度EEHI对细菌脂多糖诱导的IκBα活化的抑制作用

图5 EEHI对NF-κB-p65激活的影响

3 讨论

无刺蜂蜂胶是由无刺蜂采集的用来维持蜂群健康、防止病敌害的树脂混合无刺蜂分泌物以及泥土的一种天然特色蜂产品。国内的研究主要集中在意大利蜜蜂采集的蜂胶，由于地理和环境优势，国外对无刺蜂蜂产品研究较多，但关于无刺蜂蜂胶的药理学活性研究目前尚不全面。本研究采用的蜂胶采自马来西亚本土无刺蜂蜂种，是典型的无刺蜂蜂胶，具有一定的代表性和研究价值。

酚酸类化合物被报道具有抗氧化、抑菌、消炎、抗过敏和抑菌等生物学活性。同时，一些黄酮类化合物被报道具有抗炎、抗氧化、抗癌、保肝、肠道保护作用[19-20]。越来越多的研究结果证明，蜂胶的体外抗氧化能力与其含有丰富的总酚酸和总黄酮息息相关[21]。蜂胶的DPPH和ABTS+·自由基清除能力是评估蜂胶体外抗氧化水平的两种方法，且这两种方法具备重现性、稳定性良好的特点。蜂胶中的总酚酸、总黄酮含量是评估蜂胶质量的重要指标。通过检测蜂胶的总酚酸和总黄酮含量，笔者发现EEHI的总酚酸含量与文献报道结果一致，且比和蜂胶中的总酚酸含量高（分别为47.78和29.10 μg·mL-1）。总黄酮含量高于蜂胶（61.5 μg·mL-1）[4]，却低于文献[7]报道的163.9 μg·mL-1，推测可能是由于样品采集地点[4,22]和所采用的总黄酮当量的标准品[23-24]不同而造成。通过DPPH和ABTS+·自由基清除能力试验发现，该蜂胶虽然富含相对于蜂胶高的酚酸和黄酮，但是自由基清除能力却与文献报道存在明显差异，由此证明虽然多酚类化合物对蜂胶抗氧化能力起主要作用，但不一定高含量的酚酸和黄酮类化合物就具有最高的抗氧化能力，也可能与EEHI中酚酸黄酮类化合物的分子结构基团有关[3,25]。

炎症发生时会产生超氧自由基、过氧亚硝酸盐、过氧化氢、次氯酸和NO等高活性物质。NO是一种具有血管舒张、神经传导和炎症反应生物功能的小分子。巨噬细胞在脂多糖刺激下会促进催化精氨酸产生NO和促炎细胞因子，而在巨噬细胞中NO的过量产生会导致一系列的生理反应，如炎症、细胞毒性和自身免疫失调[26]，所以天然毒副作用小的NO抑制剂对缓解炎症反应是一个很好的选择。（诱导型一氧化氮合酶）作为一氧化氮合酶之一，是炎症条件下表达的关键酶，能够通过脂多糖诱导产生高水平含量的NO，从而影响细胞的氧化还原状态并诱导蛋白质、脂类和DNA的氧化，加速炎症反应的发生[27]；（白介素-1）是一种细胞促炎因子，在释放前列腺素中扮演着重要的角色，并且与中性粒细胞在炎症反应中的迁移直接相关[16]；（白介素-10）是一种具有释放免疫介质、呈递抗原、抑制单核巨噬细胞释放炎症因子等多功能的细胞因子；（血红素氧合酶1）能被过氧化氢、紫外线、NO等多种引起氧化应激的反应诱导，催化血红素降解产生一系列具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等分子[28]。通过Griess和RT-qPCR方法研究发现，EEHI能够极显著抑制脂多糖诱导的巨噬细胞的NO释放量，并抑制的表达，与前人报道一致[11]，EEHI能够依赖浓度关系清除NO含量，在采用脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞Raw 264.7细胞炎症反应模型中，EEHI具有与中国蜂胶和巴西绿胶相近的NO清除能力[16]。此外，相对于脂多糖刺激组，EEHI极显著抑制了细胞炎症因子基因、的表达量，并显著上调细胞中抗氧化蛋白基因的表达，表明EEHI能够通过降低细胞中炎症介质的表达，增强对其氧化应激的保护作用，从而减缓巨噬细胞的炎症反应，与文献报道相一致[10]，EEHI具有NO清除能力，且与意大利蜜蜂蜂胶（主要是中国杨树型蜂胶、巴西酒神菊属型蜂胶）及巴西无刺蜂蜂胶相同，能够通过调节炎症介质的表达缓解炎症反应的发生，如、、、等。值得注意的是，EEHI与中国杨树型蜂胶对抗炎症因子的调节作用相同，均抑制的表达，但与巴西酒神菊属型蜂胶的调节作用不一致，巴西酒神菊属型蜂胶在低浓度时促进炎症因子的表达，高浓度时表现出抑制作用[14-15,29]。

IκΒ是一种抑制NF-kB活性的抑制蛋白，正常情况下，NF-kB抑制蛋白IκΒ与P65/P50异二聚体在细胞质中相互作用从而掩盖NF-kB家族中的核定位序列。在脂多糖刺激下，IκΒ迅速磷酸化后被蛋白酶降解，导致游离的NF-kB自由进入细胞核[30]。NF-κB是具有激活转录基因功能的一组蛋白质，参与调节许多与免疫和炎症相关的基因。细胞正常状态时，NF-κB-IκΒs处于动态平衡，在受到外界刺激下，IκΒs被降解蛋白酶降解后，NF-κB家族中的核定位序列与IκΒs相互作用并携带定位信号，使被激活的NF-κB由细胞质迅速向细胞核移动。NF-κB-p65被激活后暴露出核定位位点，快速转移到细胞核中并大量分泌炎症因子，对机体产生伤害[31]。通过Western blot和免疫荧光进一步探究EEHI缓解脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应的作用机制，发现EEHI能够显著抑制IκΒ的磷酸化和炎症信号通路NF-κB-p65的激活，由此推测EEHI与中国杨树型蜂胶[15]、巴西无刺蜂蜂胶中的CNM[17]在NF-κB信号通路作用机理上可能存在一致性，主要是通过降低IκΒ的磷酸化并抑制NF-κB-p65的激活从而抑制NF-κB的激活，缓解炎症因子在细胞核内的分泌和转录，从而缓解炎症反应。

近年来，大量的研究证明植物以及蜂胶中的酚酸、黄酮具有良好的抗炎及抗氧化效果，包括山奈酚、阿替匹林-C、倒捻子素等。黄酮类化合物不仅具有清除巨噬细胞中NO的含量和降低表达的效果，更能够通过调节NF-κB以及多种蛋白信号通路缓解机体炎症的发生[13]。同时，植物中的萜烯类化合物具有潜在的自由基清除能力，并能够降低细胞中NO含量以及炎症相关因子（、）的表达，同时抑制NF-κB的活性[32]。由此，笔者推测EEHI的抗炎和抗氧化活性，不仅与其丰富的多酚类化合物密切相关，丰富的萜烯类化合物也可能为良好的抗氧化和抗炎活性提供了一定的辅助作用，而关于萜烯类化合物的活性效果需要进一步验证。

4 结论

无刺蜂蜂胶含有丰富的多酚类化合物，且具有良好的体外自由基清除能力。在细菌脂多糖诱导小鼠巨噬细胞炎症反应试验中，蜂胶乙醇提取物（EEHI）显著抑制了细胞炎症因子、的表达，上调细胞中抗氧化基因的表达，并通过降低细胞中的表达从而抑制细胞中NO的释放；另外，EEHI可通过抑制IκΒ蛋白的磷酸化和NF-κB-p65的激活从而抑制NF-κB转录因子的活性，缓解炎症反应。研究结果可为无刺蜂相关特色蜂产品开发提供理论依据。

[1] SOUZA S A, DIAS T L M F, SILVA T M G, FALCãO R A, ALEXANDRE-MOREIRA M S, Silva E M S, CAMARA C A, SILVA T M S. Chemical composition, antinociceptive and free radical-scavenging activities of geopropolis fromDucke (Hymenoptera: Apidae: Meliponini)., 2014, 61(4): 560-565. DOI: 10.13102/sociobiology.v61i4.560-565.

[2] ISMAIL M M. The potential of heterotrigona farming for a high income agro-entrepreneur project in Malaysia., 2016, 20(1): 12-17.

[3] Sanches M A, PEREIRA A M S, SERRãO J E. Pharmacological actions of extracts of propolis of stingless bees (Meliponini)., 2017, 56(1): 1-8. DOI: 10.1080/00218839. 2016.1260856.

[4] DUTRA R P, de Barros ABREU B V, CUNHA M S, BATISTA M C A, TORRES L M B, NASCIMENTO F R F, RIBIRO M N S, GUERRA R N M. Phenolic acids, hydrolyzable tannins, and antioxidant activity of geopropolis from the stingless beeSmith., 2014, 62(12): 2549-2557. DOI: 10.1021/jf404875v.

[5] ARAúJO M J A M, BOSCO S D M G, SFORCIN J M.: inhibitory effects of propolis and geopropolis on hyphal growth., 2016, 47(4): 863-869. DOI: 10.1016/j.bjm.2016.06.008.

[6] LIBERIO S A, PEREIRA A L A, DUTRA R P, REIS A S, ARAúJO M J A M, Mattar N S, Silva L A, Ribeiro M N S, Nascimento F R F, GUERRA R N M, MONTEIRO-NETO V. Antimicrobial activity against oral pathogens and immunomodulatory effects and toxicity of geopropolis produced by the stingless beeSmith.2011, 11: 108. DOI: 10.1186/1472-6882-11-108.

[7] IBRAHIM N, ZAKARIA A J, ISMAIL Z, MOHD K S. Antibacterial and phenolic content of propolis produced by two Malaysian stingless bees,and., 2016, 8(1): 156-161. http://www.researchgate.net/publication/297046720.

[8] CINEGAGLIA N C, BERSANO P R O, ARAúJO M J A M, BúFALO M C, SFORCIN J M. Anticancer effects of geopropolis produced by stingless bees on canine osteosarcoma cells., 2013, 2013: Article ID 737386. doi: 10.1155/2013/737386.

[9] COELHO G R, MENDONCA R Z, de Senna VILAR K, FIGUEIREDO C A, BADARI J C, TANIWAKI N, NAMIYAMA G, de OLIVEIRA M I, CURTI S P, SILVA P E, NEGRI G. Antiviral action of hydromethanolic extract of geopropolis fromagainst Antiherpes simplex virus (HSV-1)., 2015, 2015: Article ID 296086. DOI: 10.1155/2015/296086.

[10] 陈佳玮, 申小阁, 胡福良. 无刺蜂蜂胶化学成分及生物学活性的研究进展. 天然产物研究与开发, 2016, 28: 2021-2029.

CHEN J W, SHEN X G, HU F L. Review on chemical composition and biological activities of geopropolis., 2016, 28: 2021-2029. (in chinese)

[11] IBRAHIM N, NIZA N F S M, RODI M M M, ZAKARIA A J, ISMAIL Z, MOHD K S. Chemical and biological analyses of Malaysian stingless bee propolis extracts., 2016, 20(2): 413-422. DOI: 10.17576/mjas-2016- 2002-26.

[12] ZHAO L L, YU M J, SUN M H, XUE X F, WANG T T, CAO W, SUN L P. Rapid determination of major compounds in the ethanol extract of geopropolis from Malaysian stingless bees,, by UHPLC-Q-TOF/MS and NMR., 2017, 22(11): 1935. doi: 10.3390/molecules22111935.

[13] 王凯, 张江临, 胡福良. 蜂胶抗炎活性及其分子机制研究进展. 中草药, 2013, 44(16): 2321-2329.

WANG K, ZHANG J L, HU F L. Research progress in anti-inflammatory activity of propolis and its molecular mechanism., 2013, 44(16): 2321-2329. (in chinese)

[14] WANG K, HU L, JIN X L, MA Q X, MARCUCCI M C, NETTO A A L, SAWAYA A C H F, HUANG S, REN W K, CONLON M A, TOPPING D L, HU F L. Polyphenol-rich propolis extracts from China and Brazil exert anti-inflammatory effects by modulating ubiquitination of TRAF6 during the activation of NF-κB., 2015, 19: 464-478. DOI: 10.1016/j.jff.2015.09.009.

[15] BANG S Y, KIM J H, KIM H Y, LEE Y J, PARK S Y, LEE S J, KIM Y H.exhibits anti-inflammatory effect via NF-κΒ suppression and HO-1 induction in macrophages., 2012, 144(1): 109-117. DOI: 10.1016/j.jep.2012. 08.037.

[16] FRANCHIN M, DA CUNHA M G, DENNY C, NAPIMOGA M H, CUNHA T M, KOO H, DE ALENCAR S M, IKEGAKI M, ROSALEN P L. Geopropolis fromdecreases the mechanical inflammatory hypernociception by inhibiting the production of IL-1and TNF-., 2012, 143(2): 709-715. DOI: 10.1016/j.jep.2012.07.040.

[17] FRANCHIN M, ROSALEN P L, DA CUNHA M G, SILVA R L, COLón D F, BASSI G S, DE ALENCAR S M, IKEGAKI M, ALVES-FILHO J C, CUNHA F Q, Beutler J A, Cunha T M. Cinnamoyloxy-mammeisin isolated from geopropolis attenuates inflammatory process by inhibiting cytokine production: Involvement of MAPK, AP-1, and NF-κB., 2016, 79(7): 1828-1833. DOI: 10.1021/acs.jnatprod.6b00263.

[18] YANG H S, DONG Y Q, DU H J, SHI H M, PENG Y H, LI X B. Antioxidant compounds from propolis collected in Anhui, China., 2011, 16(4): 3444-3455. DOI: 10.3390/molecules16043444.

[19] HELENO S A, MARTINS A, QUEIROZ M J, FERREIRA I C. Bioactivity of phenolic acids: Metabolites versus parent compounds: A review., 2015, 173: 501-513. DOI: 10.1016/j. foodchem.2014.10.057.

[20] OTEIZA P I, FRAGA C G, MILLS D A, TAFT D H. Flavonoids and the gastrointestinal tract: Local and systemic effects., 2018, 61(1): 41-49. DOI: 10.1016/j.mam.2018. 01.001.

[21] 张江临, 王凯, 胡福良. 蜂胶的抗氧化活性及其分子机制研究进展. 中国中药杂志, 2013, 38(16): 2645-2652. DOI: 10.4268/ cjcmm20131621.

ZHANG J L, WANG K, HU F L. Advance in studies on antioxidant activity of propolis and its molecular mechanism., 2013, 38(16): 2645-2652. DOI: 10.4268/ cjcmm20131621. (in chinese)

[22] Araújo M J A, Búfalo M C, Conti B J, Fernandes Jr A, Trusheva B, Bankova V, Sforcin J M. The chemical composition and pharmacological activities of geopropolis produced bySmith in northeast Brazil., 2015, 4(1): 12-20. Doi: 10.5455/jmp. 20150204115607.

[23] 董捷, 张红城, 李浩, 李慧. 八种蜂花粉醇提物中总多酚和总黄酮含量测定. 食品工业科技, 2008, 29(11): 80-83.

DONG J, ZHANG H C, LI J, LI H. The contents of total polyphenols and flavonoids in ethanolic extracts from eight kinds of bee pollens., 2008, 29(11): 80-83. (in chinese)

[24] 李红兵, 米佳, 张林锁, 罗青, 李晓莺, 曹有龙, 李越鲲, 戴国礼, 冉林武, 闫亚美. 不同花粉多酚类物质组成比较. 食品研究与开发, 2015, 36(20): 111-114. DOI: 10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.030.

LI H B, MI J, ZHANG L S, LUO Q, LI X Y, CAO Y L, LI Y K, DAI G L, RAN L W, YAN Y M. The difference of the compositions of polyphenols from different bee pollen., 2015, 36(20): 111-114. DOI: 10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.030. (in chinese)

[25] SANPA S, POPOVA M, BANKOVA V, TUNKASIRI T, EITSSAYEAM S, CHANTAWANNKUL P. Antibacterial compounds from propolis ofand(Hymenoptera: Apidae) from Thailand., 2015, 10(5): e0126886. DOI: 10.1371/journal.pone.0126886.

[26] LIU R H, HOTCHKISS J H. Potential genotoxicity of chronically elevated nitric oxide: a review., 1995, 339(2): 73-89. DOI: 10.1016/0165-1110(95)90004-7.

[27] Park S Y, KIM J H, Lee S J, KIM Y H. Involvement of PKA and HO-1 signaling in anti-inflammatory effects of surfactin in BV-2 microglial cells., 2013, 268(1): 68-78. DOI: 10.1016/j.taap.2013.01.017.

[28] WANG K, JIN X L, LI Q Q, SAWAYA A C H F, LE LEU R K, CONLON M A, WU L M, HU F L. Propolis from different geographic origins decreases intestinal inflammation andspp. populations in a model of DSS-induced colitis., 2018, 62(17): e1800080. DOI: 10.1002/ mnfr.201800080.

[29] DOS SANTOS H F, CAMPOS J F, DOS SANTOS C M, BALESTIERI J B P, SILVA D B, CAROLLO C A, de Picoli Souza K, ESTEVINHO L M, DOS SANTOS E L. Chemical profile and antioxidant, anti-inflammatory, antimutagenic and antimicrobial activities of geopropolis from the stingless bee., 2017, 18(5): 953. DOI: 10.3390/ijms18050953.

[30] WANG K, PING S, HUANG S, HU L, XUAN H Z, ZHANG C P, HU F L. Molecular mechanisms underlying theanti-inflammatory effects of a flavonoid-rich ethanol extract from Chinese propolis (poplar type)., 2013, 2013: Article ID127672. DOI: 10.1155/2013/127672.

[31] PAMUKCU B, LIP G Y, SHANTSILA E. The nuclear factor – kappa B pathway in atherosclerosis: a potential therapeutic target for atherothrombotic vascular disease., 2011, 128(2): 117-123. DOI: 10.1016/j.thromres.2011.03.025.

[32] MARQUES F M, FIGUEIRA M M, SCHMITT E F P, KONDRATYUK T P, ENDRINGER D C, SCHERER R, FRONZA M.anti-inflammatory activity of terpenes via suppression of superoxide and nitric oxide generation and the NF-κB signalling pathway., 2018, DOI: 10.1007/s10787-018- 0483-z.

Antioxidative and Anti-inflammatory Activities of Ethanol Extract of Geopropolis from Stingless Bees

WANG Bei1,2, CHANG Huasong2, SU Songkun1, SUN Liping2, WANG Kai2

(1College of Bee Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002;2Institute of Apicultural Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093)

【Objective】Stingless bees are one of the important pollinators in tropic and subtropical area, differ fromwith typical stingless characteristic. Stingless bee collected more propolis thanthat of. Nevertheless, the study on the geopropolis activity was relatively scarce. The objective of this study is to evaluate theantioxidant and anti-inflammatory activities of the ethanol extract of geopropolis collected from stingless bee,, which is an indigenous stingless bee species in Malaysia. 【Method】The content of total phenolic acid and total flavonoids in the EEHI (ethanol extract ofpropolis) was determined by Folin-phenol method and AlNO3colorimetry, respectively. The antioxidant activity was investigated using DPPH and ABTS＋·free radical scavenging assays. Moreover, the inflammatory model of murine macrophage RAW 264.7 was induced by bacterial endotoxin lipopolysaccharide (LPS) and the effect of EEHI on the relative cell viability was detected via CCK-8 method. On the basis of ensuring that EEHI has no cytotoxic effect on cells, Griess method and RT-qPCR technique were applied to evaluate the effect of EEHI on the release of inflammatory mediator NO, and on the expression of inflammatory factors (,and) as well as antioxidant gene () in LPS-activated macrophages, respectively. In order to explore the potential anti-inflammatory mechanisms of EEHI, the effects of EEHI on the expression of p-IκBand IκΒin macrophages induced by LPS and the translocation of NF-κB-p65 protein were further studied by Western blot and immunofluorescence methods. 【Result】The content of total phenolic acid and total flavonoids in the EEHI was 54.70 mg GAE·g-1and 116.20 mg QE·g-1, and the IC50value of the EEHI for scavenging of DPPH and ABTS＋·free radicals was 275.60 and 284.00 μg·mL-1, respectively. The safe concentration of EEHI to RAW 264.7 cells was 0-40 μg·mL-1. In LPS-challenged macrophages, EEHI at 0-40 μg·mL-1significantly inhibited the release of NO as well as the expression of pro-inflammatory cytokine genes (,and), and enhanced the expression of antioxidant geneHO-1 in a dose-dependent manner, compared with the LPS-treated control. Furthermore, it was noticed that EEHI at 0-40 μg·mL significantly inhibited the LPS-stimulated phosphorylation of IκΒαprotein in a dose-dependent manner, and EEHI at 40 μg·mL-1significantly reduced the nuclear migration of NF-κB-p65 protein. It was suggested that EEHI had potential anti-inflammatory effects by inhibiting the activation of NF-κB inflammatory signaling pathway induced by LPS.【Conclusion】The ethanol extract of geopropolis collected fromcontains a large number of polyphenols, which has good antioxidant and anti-inflammatory effects, and is of great value for exploitation and utilization in the future.

stingless bee; geopropolis; antioxidant; anti-inflammatory; NF-κB

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.05.015

2018-09-28；

2018-11-30

国家自然科学基金青年科学基金（31702287）、国家蜂产业技术体系专项（CARS-44）、国际合作项目“常青蜂场蜂胶有效成分鉴定”

王蓓，E-mail：m13121180309@163.com。通信作者王凯，E-mail：kaiwang628@gmail.com

（责任编辑 岳梅）