牦牛瘤胃微生物研究进展

梁泽毅，张剑搏，李 晨，丁学智

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050）

瘤胃是目前已知纤维素类物质降解速率最快的生物反应器，而牦牛作为常年生活于低压缺氧、严寒、食物匮乏的青藏高原上的大型家畜，较其他反刍动物拥有更快的纤维素降解速率。相关研究表明，瘤胃发酵的效率越高，所合成的发酵终产物就越好。目前，研究者们采用传统分离鉴定方法和分子生物学技术对牦牛瘤胃微生物的种类和数量进行了大量研究。发现牦牛瘤胃内部的微生物包括细菌、原菌、古菌、原虫以及噬菌体等，若以细胞个数计算，瘤胃微生物的总细胞数是反刍动物自身细胞数的10倍以上［1］，通常情况下每毫升瘤胃内容物中有不同种类细菌数量1010～1011个、原虫数量 105～106个、厌氧真菌（游离孢子数为 103～105个）和少数噬菌体它们相互作用与反刍动物共生［2］。Xue等［3］应用细菌16S rRNA基因和mcrA基因克隆文库的高通量测序来研究瘤胃原核生物群落结构发现，牦牛瘤胃原核生物群落由29门，40纲，63目，77科和79属组成，其中数量最多的是厚壁菌门、拟杆菌门以及变形菌门。Chevalier等［4］研究发现，疣微菌门可以帮助牦牛在寒冷胁迫下提高自身的能量转化效率以抵御寒冷。但是瘤胃内的微生物关系错综复杂，这一巨大的微生物资源有待进一步发掘。因此，本文对牦牛瘤胃微生物的研究进展进行了综述，旨在为牦牛瘤胃微生物资源利用提供参考。

1 不同品种牛瘤胃微生物间的差异

牦牛是世界上唯一能够在海拔3 000～5 000 m的高山地区和亚高山地区生活的大型反刍动物，其天然的独特性，引发科研人员的研究兴趣。Ding等［5］研究发现，牦牛瘤胃中甲烷菌的多样性高于其他反刍家畜。更早的研究证明，牦牛在长期进化过程中形成了适应青藏高原极端环境的特定机制，使其消化和代谢与其他反刍家畜有较大差异，这可能也是牦牛甲烷排放量较低的原因。安登弟［6］通过对牦牛瘤胃微生物基因组文库构建16S rDNA生物多样性的研究发现，牦牛瘤胃微生物以降解纤维素的微生物为主，降解淀粉的微生物较少；而黄牛的瘤胃中则分解纤维素的微生物较少，分解淀粉的微生物较多，这可能与牦牛生存环境和其采食有关。刘开朗等［7］通过对鲁西肉牛、荷斯坦奶牛、晋南牛、牦牛、黄牛和Hanwoo六个不同品种牛的瘤胃微生物群落进行了比较分析，发现牛的品种是造成瘤胃细菌群落差异的重要因素，且品种对瘤胃细菌群落的影响大于日粮或其他因素。

2 不同年龄段牦牛瘤胃微生物的变化

在整个生命周期中，牦牛瘤胃微生物的数量、种类处于一种动态平衡状态。反刍动物出生时其消化道微生物并不像成年反刍动物那样丰富，出生时消化道内不存在厌氧细菌、厌氧真菌和原虫，在与母体及外界环境不断接触的过程中，微生物区系才在瘤胃及其他消化道部位逐渐建立起来。ØRskov等［8］研究发现，每一生长阶段的牦牛瘤胃微生物的数量和种类都存在差异，在哺乳阶段牦犊牛瘤胃并未发育完全，只能通过食管沟反射将乳汁直接导入皱胃进行消化吸收，此阶段牦牛的消化代谢方式与其他单胃动物相似，主要以化学消化为主，但随着其年龄的增长、采食方式的改变以及各类瘤胃微生物的定植，逐渐形成了以分解纤维素类的微生物为主的瘤胃微生物。Mao等［9］研究发现，成年牦牛和老年牦牛瘤胃微生物古菌序列不仅有公共的序列，同时也有各自的特有序列，表明成年牦牛和老年牦牛的瘤胃微生物的种类存在差异。Jiao等［10］的研究结果表明，厚壁菌门在3个优势种群（厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门）中所占的比例最高，不同年龄组之间维持在50%左右，而其他反刍动物则是以拟杆菌门为优势菌群。但是拟杆菌门的增加呈现出了阶梯式的增长，这也从另一方面证明瘤胃微生物的增长并不是只与年龄有关，也可能和采食的日粮类型有着密切的关系［11］。广古菌门在牦牛瘤胃细菌/甲烷菌定植过程中随年龄呈增加的趋势。变形菌门主要负责降解日粮中的可溶性糖、脂肪和氨基酸。幼年牦牛以母乳作为唯一日粮，乳中富含这些营养成分。但是当牦牛开始采食牧草，其瘤胃微生物中变形菌门迅速降低。放线菌门和梭杆菌门也呈现出随着年龄的增加而降低的趋势，但是它们在牦牛瘤胃中的比例要高于其他反刍动物，在反刍动物出生时，瘤胃并不是严格的厌氧环境，需要高比例放线菌门来促使牦牛瘤胃更迅速地消耗掉瘤胃内的氧气并建立厌氧的环境，让牦犊牛更快形成稳定、成熟的瘤胃微生物环境，以适应恶劣的生长条件。Jami等［12］饲喂给6月龄和2周岁牛相同的饲料，发现2组牛的瘤胃微生物仍然存在显著差异，表明在6月龄时，饲料种类对瘤胃微生物的影响明显低于年龄对其的影响。Van［13］研究发现，在幼年和成年动物瘤胃中的细菌群落几乎没有共同的菌属。这可能是因为在出生的最初几天其瘤胃尚未开始活动，故没有参与饲料的消化。细菌群落中的同组相似性随着年龄的增长而增加。这表明成熟的瘤胃环境虽然更加多样化，但是相对于原始环境，是一个更加特殊、更加均质的细菌群落。牦牛瘤胃微生物在牦牛的不同生长时期存在变化，这与其生长阶段和营养来源有着密切的关系。

3 瘤胃微生物随季节变化的规律

牦牛主要分布在青藏高原，其主要植被为高寒草甸，但是由于牧草冷季远比暖季长，牧草生长期较短而枯草期较长，且牦牛饲养方式基本以放牧为主，致使牦牛处于“夏饱、秋肥、冬瘦、春乏”的循环［14］。在枯草期，牧草中的纤维含量高于暖季（夏季），牦牛为了生存就必须拥有更高效的消化系统，而瘤胃作为消化系统中主要的消化器官，其内部的微生物群系会伴随着季节变化而产生微小的变动。有研究发现，反刍动物瘤胃中的疣微菌门在冷季的比例要高于暖季，大量的疣微菌可帮助机体在寒冷胁迫下提高机体的能量转化效率，而黏胶球形菌门也有类似的趋势，这两种菌门可能在应对寒冷胁迫方面作用相同。牦牛瘤胃微生物的季节变化主要受所采食的牧草营养成分和环境气温变化。米见对［11］从门水平上研究了牦牛瘤胃微生物受季节影响的情况，发现不同季节牦牛瘤胃微生物的丰富度存在差异，见图1。姚军等［15］通过研究牦牛和藏羊瘤胃内纤毛虫在冷季和暖季的变化，发现牦牛、藏羊瘤胃内的纤毛虫在冷季时的数量明显少于暖季，并且纤毛虫的组成也存在明显差异；纤毛虫中降解纤维素的双毛属、前毛属、头毛属在冷季占比高于暖季。牦牛瘤胃季节性的变化表明与外界环境有着密切关系。在食物短缺的冷季牦牛需要更多的能量维持生存，瘤胃中降解纤维素的菌种数量增多，纤毛虫数量减少。

图1 不同季节牦牛瘤胃细菌/古菌门水平的组成［11］

4 牦牛瘤胃微生物的影响因素

瘤胃作为一个重要的天然发酵罐，依赖瘤胃内大量微生物群体的协同作用，将反刍动物摄入的纤维类物质快速降解转化成一系列机体所需的营养物质。瘤胃微生物作为可降解、转化植物纤维素类物质效率最高的天然体系，也受各种因素的影响。Shanks等［16］的研究结果表明，不同饲喂条件下牛肠道内的微生物群落结构和种类都存在差异，且在不同饲粮条件下的微生物群体结构有明显的不同。Shanks等［17］在体外人工模拟瘤胃发酵试验中，采用特定氨基酸缺省底物的方法研究了微生物自身的限制性氨基酸，结果表明，氨基酸限制性作用的大小排序：支链氨基酸＞芳香族氨基酸＞蛋氨酸＞赖氨酸；细菌和原虫内部菌群结构也发生了相应的变化。Bao等［18］研究发现，瘤胃正常发挥功能，主要依靠的是内环境的稳定，而pH值和挥发性脂肪酸对瘤胃内环境的稳定发挥着重要的作用，牦牛瘤胃内pH值保持在6～7，pH值的变化直接影响纤维素降解菌的活性。当pH值低于6.2时，纤维素的降解会受到抑制。许黛君［19］研究发现，挥发性脂肪酸也为瘤胃微生物提供了适宜的生存条件，牦牛瘤胃内的碳水化合物经过发酵产生挥发性脂肪酸，它是牦牛主要的能量来源，也是牦牛合成乳脂和体脂的原料。同时挥发性脂肪酸的存在又在调节瘤胃渗透压和pH值等方面发挥了作用，为瘤胃微生物降解纤维素提供了良好的保障。瘤胃微生物的组成也受日粮精粗比的影响，精料饲养模式会增加瘤胃淀粉降解菌的数量，而粗料的供给会促进纤维降解菌的生长。杨宏波等［20］的研究表明，高精料全价颗粒饲料虽然对犊牛瘤胃TVFA、乙酸、丁酸和乙酸/丙酸的水平起到促进作用，但对瘤胃纤维降解菌和厌氧真菌有显著的抑制作用，适当的粗料供给会有利于瘤胃健康发育和反刍行为的形成［21］。但需要注意的是幼年动物对于纤维物质的降解功能尚不完善，若过早或过多地饲喂粗饲料，不利于反刍动物瘤胃的发育。Jiao等［22］采用对比试验研究了放牧和圈养2种不同饲养方式对山羊瘤胃功能和微生物定植的影响，发现不同管理模式与山羊瘤胃中的相关酶类、生理形态以及微生物的定植有密切关系。综上所述，影响牦牛瘤胃微生物的变化因素，一方面是源于自身，如受遗传因素、自身瘤胃的调节、生长发育阶段、年龄等的影响；另一方面来源于外界环境，如采食日粮的种类、季节的变化、生长的环境气候等。因此，牦牛瘤胃能否健康而快速的发育，取决于是否有健康的微生物定植于瘤胃系统，而不同的管理模式和饲养水平对瘤胃微生物的定植过程有重要影响，其具体影响作用有待详细研究。

5 小结

瘤胃作为反刍动物体消化道内的黑匣子，其内部大量的微生物之间相互作用成为一个密不可分的整体，构成了一个生态系统。随着生物技术的快速发展，人们利用宏基因组学将所有瘤胃微生物的基因看作整体进行分析，越来越多的微生物功能已被发现。未来随着宏基因组、宏转录组学、宏蛋白组学以及代谢组学的相互结合，从基因、转录、转录后、翻译及翻译后的水平上共同研究牦牛瘤胃微生物群落的结构、代谢功能和调控规律已成为可能。从不同年龄、不同季节瘤胃微生物以及犊牛瘤胃微生物的定植结果来看，在未来的研究中，将某一消化功能较强的反刍瘤胃微生物移植到这方面较弱的反刍动物体内，或是按照前一种动物的瘤胃微生物的分布对后一种动物瘤胃微生物进行调控是可行的。