血清IL-8 CXCR1 CXCR2表达与2型糖尿病视网膜病变的相关性研究

肖巍 高建波 马雅娟 陈林秀

作者单位：314000 浙江省荣军医院眼科

糖尿病视网膜病变是2型糖尿病患者较为常见的并发症，其主要临床表现为出血斑点、视网膜内微血管异常及黄斑水肿等导致患者视力下降甚至失明［1］。研究表明其发病机制与患者体内炎性反应、氧化应激反应密切相关［2］。2型糖尿病视网膜病变具有较高的发病率并严重影响患者的健康及生活质量，因而积极寻找与疾病相关的生物学指标对改善视网膜病变具有重要意义。研究表明IL-8与机体氧化应激反应有关，并可促使中性粒细胞、淋巴细胞等发生趋化反应而发挥其生物学效应［3］。IL-8与其CXCR1及CXCR2相互作用可参与肿瘤细胞增殖、新生血管形成及炎症反应等病理过程。目前关于IL-8与CXCR1、CXCR2在2型糖尿病视网膜病变中的研究相对较少，因此本研究主要探讨血清IL-8、CXCR1、CXCR2表达与2型糖尿病视网膜病变的相关性，为临床早期诊断及治疗糖尿病视网膜病变提供一定理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年1月至2016年5月于本院诊治的2型糖尿病视网膜病变患者61例为研究组，另选取同期于本院进行体检的健康人员55例为对照组。研究组中男37例，女24例；年龄45～76岁，平均（60.12±10.23）岁，糖尿病病程8～17月，平均（12.15±2.02）月。对照组中男31例，女24例；年龄43～78岁，平均（60.51±10.03）岁。根据视网膜病变分期标准将研究组患者分为增殖性视网膜病变（PDR）35例与非增殖性视网膜病变（NPDR）26例。纳入标准：（1）2型糖尿病视网膜病变患者符合相关诊断标准［4］；（2）既往无眼部手术史者；（3）患者均签署知情同意书。排除标准：（1）患有其它眼部疾病者；（2）患有血液病或代谢性疾病者；（3）患有1型糖尿病者；（4）严重肝肾功能不全者；（5）合并恶性肿瘤及免疫系统疾病者。两组临床资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法 （1）主要试剂：Trizol试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，反转录试剂盒购自Fermentas公司，qRT-PCR试剂盒购自美国Invitmgen公司，CXCR1与CXCR2兔抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公 司。（2）qRT-PCR法 检 测 两 组 血 清 IL-8、CXCR1、CXCR2 mRNA表达水平：两组受试人员于次日清晨抽取空腹静脉血5 ml，并经简单离心后吸取上层血清于抗凝试管中，按照Trizol试剂盒操作步骤提取总RNA。采用反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。采用PCR试剂盒进行qRT-PCR反应并检测IL-8、CXCR1、CXCR2 mRNA的相对表达量，反应体系为20μl：10μl 2×SYBR Mix，10×cDNA模板1uL，上下游引物各1μl，H20 8μl，反应程序设定为95℃ 5min（预变性），95℃ 30s（变性）、60℃ 30s（退火），72℃ 1min（延伸），共 30个循环，72℃ 10min（终延伸）。每个样本设置3个平行反应复孔。在PCR仪上进行反应，其中引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。反应结束后对数据进行分析，其中IL-8、CXCR1、CXCR2均以GADPH作为内参按照2-ΔΔCt算法进行计算基因相对表达量。（3）Western blotting法检测CXCR1、CXCR2蛋白表达水平：采用Western blotting法检测CXCR1、CXCR2蛋白表达，血清中加入蛋白裂解液，采用玻璃匀浆器匀浆至组织破碎并在冰上裂解30min，简单离心3min后将上清液转移至另一EP管中测定蛋白浓度，取40μg蛋白样品与上样缓冲液混合煮5min，之后进行SDS-PAGE凝胶电泳并电转移至PVDF膜。封闭液封闭并加入兔抗人CXCR1/CXCR2多克隆抗体（1：2000），4℃过夜并清洗后加入二抗室温孵育120min，TBST清洗3次。采用ECL（增强化学发光法）试剂盒发光显影并运用分析软件对条带灰度值进行分析，以β-actin为内参对显影条带进行计算CXCR1/CXCR2蛋白相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 测定及观察指标 两组受试人员均空腹12h后分别抽取静脉血3ml，简单离心后分离血清，采用全自动生化分析检测腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbAlc）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，并分析上述指标与IL-8、CXCR1、CXCR2的相关性。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料采用χ2检验；Pearson法进行相关性分析；Logistic法分析影响2型糖尿病视网膜病变的危险因素，各组数据均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料的比较 见表2。

表2 两组临床资料的比较（x±s）

2.2 两组血清IL-8与CXCR1、CXCR2 mRNA及蛋白表达水平的比较 见图1、表3、表4。

表3 两组血清IL-8、CXCR1、CXCR2 mRNA表达水平的检测结果（x±s）

表4 两组CXCR1、CXCR2 蛋白表达水平的比较（x±s）

2.3 研究组患者血清IL-8与CXCR1、CXCR2及其与临床指标的相关性分析 IL-8均分别与CXCR1、CXCR2呈显著正相关（P＜0.05）。IL-8与FPG、TC、LDL-C、TG 及 HbAlc呈 显 著 正 相 关（P＜0.05）；CXCR1与FPG、TC、TG呈显著正相关（P＜0.05）；CXCR2与FPG、TC、LDL-C、TG 及 HbAlc呈显著正相关（P＜0.05），且均与LDL-C水平无明显相关性（P＞0.05）。

2.4 2型糖尿病患者发生视网膜病变的多因素分析 将影响2型糖尿病患者发生视网膜病变的多因素进行Logistic多元回归分析，结果显示IL-8、CXCR1、CXCR2、FPG及HbAlc均是2型糖尿病视网膜病变的危险因素。

图1 CXCR1与CXCR2的蛋白表达情况

3 讨论

本研究通过qRT-PCR法检测2型糖尿病视网膜病变患者与健康人员血清中IL-8 mRNA表达水平，结果显示研究组患者IL-8 mRNA表达水平显著高于对照组，且PDR患者血清中IL-8 mRNA表达水平显著高于NPDR，说明2型糖尿病视网膜病变患者血清中IL-8呈高表达并可参与疾病发生发展过程。相关研究表明2型糖尿病视网膜病变患者的临床生化指标FPG、TG、TC、LDL-C、HbAlc等可通过诱导视网膜新生血管的形成进而影响疾病的发生发展［5］。本研究结果显示，研究组患者FPG、TC、LDL-C、HbAlc均显著高于对照组。说明2型糖尿病视网膜病变患者FPG、TG、TC、LDL-C、HbAlc在其产生及发展中发挥重要作用且与疾病严重程度密切相关。本研究对IL-8与患者的临床指标进行相关性分析，结果显示IL-8与FPG、TC、LDL-C、TG及HbAlc呈显著正相关，说明IL-8表达水平升高可能与FPG、TG、TC、LDL-C、HbAlc相互作用进而促使视网膜新生血管的形成并导致病变的发生有关，患者血清中IL-8水平越高其疾病进展越快。CXCR1、CXCR2定位于人染色体2q35是CXCR家族的重要成员，其主要在中性粒细胞、T淋巴细胞及单核细胞中表达并可参与机体局部炎症反应或全身性的应激反应。趋化因子CXCR1、CXCR2是由组织细胞与炎性细胞合成并分泌的碱基肝素结合型小分子蛋白，具有促血管生成及诱导炎性细胞趋化的作用并可与其相应趋化因子受体结合后发挥其生物学效应。本研究通过qRT-PCR法检测其表达水平，结果显示研究组患者CXCR1、CXCR2 mRNA表达水平显著高于对照组，此外，Western blotting分析结果显示研究组患者CXCR1、CXCR2蛋白表达水平显著高于对照组，说明2型糖尿病视网膜病变患者体内CXCR1、CXCR2表达水平显著升高，并参与视网膜病变的发生过程。同时本研究采用Pearson法将CXCR1、CXCR2表达与患者临床指标进行相关性分析，结果显示CXCR1与FPG、TC呈显著正相关，CXCR2与FPG、TC、LDL-C及HbAlc呈显著正相关，说明随着2型糖尿病视网膜病变的进展加快，CXCR1、CXCR2表达也随之发生变化，推测CXCR1、CXCR2可预测2型糖尿病视网膜病变的进展情况。

相关研究表明，IL-8与CXCR1、CXCR2结合后细胞胞浆区构象发生改变并可促使G蛋白释放GDP进而与GTP结合，其可通过介导部分信号通路而促使甘油二酯及三磷酸肌醇的产生并可提高细胞内钙离子浓度进而激活钙调蛋白激酶并释放活性产物最终引发机体炎症反应。然而，IL-8与CXCR1、CXCR2结合后发挥的功能不同，研究表明IL-8与CXCR1结合后可介导中性粒细胞发生趋化并促使超氧化物的产生等生理过程，IL-8与CXCR2结合后可通过与巨噬细胞炎性蛋白等结合而参与血管形成及其它炎性疾病的发生过程［6］。本研究对IL-8与CXCR1、CXCR2的相关性进行分析，结果显示CXCR1、CXCR2均与IL-8呈显著正相关，说明2型糖尿病视网膜病变血清中IL-8通过与上调的CXCR1、CXCR2结合后并介导炎性细胞等向视网膜组织聚集及浸润从而加重组织损伤。同时本研究对影响2型糖尿病患者发生视网膜病变的相关因素进行Logistic多元回归分析，结果显示IL-8、CXCR1、CXCR2、FPG及HbAlc均是2型糖尿病视网膜病变的危险因素。本研究结果显示IL-8、CXCR1、CXCR2可通过促进机体内炎症反应、血管生成而损伤视网膜组织并影响2型糖尿病视网膜病变的发生和发展，三者均与视网膜病变有关并可作为预测2型糖尿病视网膜病变患者病情进展的重要标志物。