AMF抗奈达铂耳蜗氧化损伤及调控Caspase-3表达的临床研究

孙瑶 李彦 施谷平 潘欢 赵慧云 司马国旗*

作者单位： 314000 浙江省嘉兴市第一医院暨嘉兴学院医学院附属第一医院

文献表明［1-2］铂络合物作用于耳蜗，导致抗氧化物质减少、活性降低，氧自由基活动增加以及抗氧化酶类的活性丧失等原因是其耳毒性的重要因素之一。另一方面，铂络合物作用于靶目标耳蜗毛细胞，启动凋亡基因，诱导程序化死亡也是导致其耳毒性重要理论之一［3］。氨磷汀（amifostine，AMF）作为世界上第一个被认可的广谱细胞保护剂，已经广泛应用于减弱化疗所致的毒副作用。AMF属于胺基硫醇类。其分子机制主要表现为诱导组织低氧、转移并清除自由基以及增强DNA稳定性等［4］，这恰巧与铂络合物所致耳毒性机制相符合。作者通过本临床研究探讨AMF抗奈达铂耳蜗氧化损伤的临床疗效及调控Caspase-3表达的作用机制。

1 临床资料

1.1 一般资料 根据入组标准将本院 2017年1月至12月拟行奈达铂联合伊立替康（IN）方案化疗的肺癌术后患者140例按意愿分为观察组（90例）和对照组（50例）。140例患者中男95例，女45例；年龄 37～74岁，平均（62.7±14.9岁）。对照组患者行IN方案化疗，观察组患者在行IN方案化疗的基础上加用AMF。入组标准：（1）非小细胞肺癌术后需行IN方案化疗的初治患者（连续规律化疗≥6个周期）；（2）除外曾因罹患其他系统肿瘤行化疗患者；（3）除外存在感染性疾病、免疫性疾病、血液系统疾病、活动性肝炎及其他肝性疾病者；（4）除外短期内（6个月内）曾服用耳毒性药物患者；（5）除外曾罹患耳部疾病患者；（6）除外研究开始首次行畸变产物耳声发射（DPOAE）检测听力异常患者。排除标准：（1）因各种原因未按疗程完成化疗患者（化疗＜6个周期或未连续规律化疗）；（2）研究期间使用耳毒性药物患者；（3）失访患者。两组患者性别、年龄、肿瘤分期之间差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 评价指标 （1）功能学：对观察组及对照组患者在化疗前后分别行DPOAE检测，检测患者双耳1000～8000Hz的 DPOAE听力图（Madsen CAPELLA）。选择初始纯音f1和f2，使f2/f1=1.22，强度差L1-L2=10dB SPL，DPOAE 幅值超过本底噪声3dB以上为检出标准，测试频率 f0［f0=（fl×f2）/2］分别为1、2、4、6、8kHz处的信噪比（dB SN）差值。同时评估两组患者化疗后耳部听力临床症状，特别注意耳鸣或耳部闷胀感的患者。（2）血清学：采用脂质过氧化产物MDA、自由基清除物T-SOD及谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX测定试剂盒（上海索宝生物科技有限公司），按使用说明检测各组患者化疗后血清相关指标活力。（3）分子生物学：采用Western-blot法对化疗后两组患者外周血中Caspase-3蛋白表达水平进行检测。采用WB及IP细胞裂解液抽提外周血中总蛋白，并测定浓度，加入蛋白上样缓冲液，沸水浴5min变性，调整上样量，使上样总蛋白量为30μg/孔，进行电泳。湿转法将蛋白转印至PVDF膜，一抗（1∶1000），4℃孵育过夜；二抗（1∶2000），37℃孵育2h。充分洗膜后，将PVDF膜置于凝胶成像分析系统中，膜上加ECL工作液2ml，调整曝光时间至60s，采集图像，并采用系统中自带分析软件测定目的条带和内参条带灰度值，以目的条带灰度值/内参条带灰度值的比值作为该样本目的蛋白表达的相对水平进行统计分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组化疗前DPOAE的dB SN差值变化 见表1。

表1 两组患者化疗前DPOAE的dB SN 差值变化［dB SN，（±s）］

表1 两组患者化疗前DPOAE的dB SN 差值变化［dB SN，（±s）］

组别 1.0kHz 2.0kHz 4.0kHz 6.0kHz 8.0kHz观察组（n=90） 7.3±1.8 7.1±1.1 8.7±1.3 8.9±0.9 8.9±1.5对照组（n=50） 6.9±2.1 9.9±0.8 8.5±1.6 9.0±1.3 9.1±1.2 t值 1.667 1.435 1.561 1.663 1.290 P值 0.111 0.233 0.183 0.113 0.287

2.2 两组化疗后DPOAE的dB SN 差值变化 见表2。

表2 两组患者化疗后DPOAE的dB SN 差值变化［dB SN，（±s）］

表2 两组患者化疗后DPOAE的dB SN 差值变化［dB SN，（±s）］

组别 1.0kHz 2.0kHz 4.0kHz 6.0kHz 8.0kHz观察组（n=90） 5.1±0.8 5.6±1.0 4.3±1.1 4.0±1.4 4.3±1.3对照组（n=50） 3.3±1.1 3.5±0.7 2.7±0.9 1.3±0.4 1.6±0.5 t值 1.996 2.013 2.231 2.998 2.736 P值 0.041 0.038 0.023 0.004 0.009

2.3 两组患者血清学各指标活力值 见表3。

表3 两组患者血清学各指标活力值（s）

表3 两组患者血清学各指标活力值（s）

组别 MDA（nmol/ml） T-SOD（U/mol） GSH-PX（U）观察组（n=90） 3.01±0.31 129.56±9.31 586.31±60.21对照组（n=50） 9.13±0.56 93.12±6.31 211.98±34.21 t值 2.414 2.301 2.242 P值 0.037 0.040 0.018

2.4 临床症状 观察组患者4例（4/90，4.4%）出现不同程度耳鸣或耳部闷胀感，明显低于对照组16例（16/50，32.0%），差异有统计学意义（χ2=3.37，P=0.22）。

2.5 分子生物学检测 外周静脉血中，观察组Caspase-3蛋白表达量低于对照组，组间差异有统计学意义（t=2.626，P=0.013），见图1。

图1 Western-blot法对两组Caspase-3蛋白检测结果

3 讨论

功能学方面，同样接受6个周期IN方案化疗的患者，观察组出现耳鸣或耳部闷胀感的患者数量明显少于对照组，组间差异有统计学意义（P＞0.05），说明AMF可有效缓解奈达铂耳毒性所致的临床症状，从而增加患者化疗的耐受性。同时DPOAE听力图表明：本研究中患者在l、2、4、6、8kHz处的dB SN差值，观察组大于对照组，组间差异有统计学意义（P＜0.05），且随着频率的上升，差异越大，尤其是在6、8kHz处的dB SN差值，观察组明显大于对照组，组间比较有显著差异（P＜0.01），表明AMF对奈达铂所致耳蜗氧化损伤有保护作用，且频率愈高，保护效果愈佳，这也符合铂络合物致耳蜗氧化损伤“低频-高频”对应“顶回 -底回”的规律［5］。

研究表明，铂络合物可直接抑制组织的抗氧化系统，使抗氧化酶GSH-PX及 T-SOD的活性下降，催化氧自由基，使生物膜中的不饱和脂肪酸过氧化引起细胞损伤，并因此形成脂质过氧化产物如MDA，而AMF能逆转改作用。本研究结果也符合了这一结论，观察组相比对照组，T-SOD及GSH-PX活力值明显升高，MDA活力值明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。由此说明，AMF可通过减少耳蜗毛细胞氧自由基产生并提升其抗氧化系统来减少奈达铂所致的耳毒性。

Caspase蛋白家族是细胞凋亡信号传递及调节的转移因子，在其家族成员中，Caspase-3是执行细胞凋亡的关键蛋白，负责对全部或部分关键蛋白进行酶切，通过激活JNK/c-JUN信号通路诱使DNA片段化，启动细胞凋亡程序。而对AMF的研究发现，其活性成分游离硫醇（WR-1065）与DNA及核蛋白结合后，染色质的核小体结构发生变化，减少了核小体的降解，使化疗后正常细胞凋亡现象明显减少［6］。本研究也对观察组及对照组患者外周血Caspase-3蛋白表达进行了检测，结果表明，观察组Caspase-3蛋白表达量低于对照组，组间差异有统计学意义（P＜0.05），间接说明观察组细胞凋亡率低于对照组，推测AMF可通过抑制奈达铂所致耳蜗毛细胞凋亡，减少奈达铂所致耳毒性。但Pataer等［7］研究发现单用AMF诱导肺癌细胞系凋亡存在剂量相关性，说明AMF具备诱导细胞凋亡的作用，因此国内外对于AMF是否影响细胞凋亡，并以此产生对化疗疗效及副反应的影响尚存有争议，值得更深入探讨。