乳酸菌细菌素研究进展 及其在水产养殖和加工中的应用

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(1.上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093; 2.中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090; 3.福建省闽东水产研究所,福建宁德 352100)

我国是水产养殖大国,养殖产量自1990年开始连年居世界首位,消费者对水产品的需求量也日益增加[1]。然而,水产品在养殖、加工储运过程中易受到有害微生物的侵害和污染,这就影响水产品的养殖产量及食用安全。常用抑菌方式有通过添加抗生素等抑菌物质以及采用高温高压灭菌等灭菌方式来抑制水产养殖及加工过程中有害微生物的侵染[2]。然而高温高压灭菌会引起水产品中热敏性营养成分的流失,造成其品质和营养价值的下降;防腐剂、保鲜剂等食品添加剂可能对人体具有潜在危害;抗生素在水产养殖过程中的过度使用,会造成养殖水体、水产品的污染和耐药性细菌的产生[3]。当前耐药性致病菌在水产品中发现频率越来越高,已经严重威胁到人类健康安全,引起了水产养殖业及加工业极大地关注[3]。因此寻求天然、安全和高效的抑菌剂对水产品加工及养殖行业发展具有一定的促进作用。

细菌素是一类由核糖体合成,对同种或种属关系较近的细菌具有抑制作用的多肽或蛋白质[4]。与传统的抗生素不同,细菌素由基因编码,核糖体合成,抗菌谱较窄、抑制目标微生物具有特异性强的特点,因此细菌素抑菌效能高。抗生素是由微生物发生酶促反应而合成的次级代谢产物,抗菌谱较细菌素广,而抑菌效应较细菌素低。抗生素作用方式比较多,可以通过阻碍细胞壁合成、增强细胞膜的通透性、抑制蛋白质合成、阻碍DNA复制及转录、影响细菌的代谢等方式达到抑菌效果[4-5];而已知的细菌素抑菌作用方式单一,主要是通过形成孔道或者溶解细胞膜来对细菌进行抑制[4]。

乳酸菌被普遍认为是安全的微生物,因此乳酸菌细菌素也可当做传统食品添加剂和抗生素的替代品[6]。然而,目前乳酸菌细菌素中只有乳酸链球菌素(nisin)通过FDA/WHO认证,并进行产业化生产,其主要原因是大部分乳酸菌细菌素的作用机理研究得不够清楚,从而影响了乳酸菌细菌素的进一步应用[6-7]。本文根据现有乳酸菌细菌素的研究进展,按照乳酸菌细菌素的特征进行分类,并阐述其抑菌机理,总结乳酸菌细菌素在水产养殖及加工方面的应用研究,为乳酸菌细菌素的进一步应用提供参考。

1 乳酸菌细菌素的分类

乳酸菌细菌素的分类较复杂,且一直存在争论[8-12]。Klaenhammer[8]将细菌素分为四类:I类是以乳链菌肽为代表的低分子量(<5 kDa)的羊毛硫抗生素类热稳定肽;II类为小分子量(<10 kDa)非羊毛硫抗生素类热稳定肽,包括IIa、IIb和IIc三个亚类;III类是高分子量(>30 kDa)的热不稳定肽;IV类是肽与碳水化合物或脂质的复合物。Cleveland等[9]认为IV类细菌素是未完全纯化的一类细菌素,所以不是一类新的细菌素。Cotter等[10]提出了一种新的分类方法,将细菌素分为两类:羊毛硫抗生素类细菌素(I类),非羊毛硫抗生素类细菌素(II类),将III类细菌素定义为溶菌素,取消了IV类细菌素的分类。Drider等[11]根据细菌素的生化特征将乳酸菌细菌素分为三大类:I类是热稳定的短肽(19～38氨基酸残基);II类由具有两亲螺旋结构的小型热稳定肽(<10 kDa)组成;III类是有复杂活性和蛋白质结构的大分子量的(>30 kDa)热不稳定细菌素。根据细菌素的生物、物理、遗传特性以及抑菌作用等特点,将乳酸菌细菌素分为四类(见表1)。

表1 乳酸菌细菌素的分类Table 1 Classification of bacteriocins produced by LAB

1.1 I类乳酸菌细菌素

I类乳酸菌细菌素是短肽/羊毛硫抗生素类抑菌肽(<5 kDa,19～37个氨基酸),其一级结构中含有氨基酸羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸[25-26]。I类乳酸菌细菌素是翻译后修饰的热稳定肽,该类细菌素通常对革兰氏阳性菌有高效的抑制作用[27]。根据形态的不同又可以分为两个亚类:Ia类和Ib类乳酸菌细菌素。Ia类乳酸菌细菌素是细长型的,分子量在2～4 kDa之间,nisin是这类细菌素的典型代表[13-14]。Ib类乳酸菌细菌素是典型的球状,分子量在2～3 kDa之间,带负电荷或无净电荷的细菌素[28]。

1.2 II类乳酸菌细菌素

II类乳酸菌细菌素是具有热稳定性,分子量小(<10 kDa),类似片球菌素的非修饰抑菌肽。分为以下六个亚类:

1.2.1 IIa类乳酸菌细菌素 IIa类乳酸菌细菌素一般由37～48个氨基酸残基组成,这些氨基酸残基具有β-折叠片构型、带正电荷、高保守的亲水性N端和一到两个低保守的两亲性或疏水性α-螺旋的C-末端。IIa类细菌素等电点一般较高,存在亲水性N-末端,通过ABC运输转运共有序列Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys[YGNGV(X)C(X)C(X)V(X)A]的系统[15-16];IIa类乳酸菌细菌素对李斯特菌(Listeriaspp.)有较强的抑制活性,因此IIa类乳酸菌细菌素在乳制品中具有很大的应用价值[28-31]。

1.2.2 IIb类乳酸菌细菌素 IIb类乳酸菌细菌素(双肽细菌素)是由两种不同的氨基酸肽类寡聚体形成,可以进一步细分为E-型和S-型两个类型。E-型是功能增强型,即每个多肽都有活性,但抑菌活性会随着另一个多肽的存在而增强,代表性的是Lactacin F[17];S-型是功能协同型,此类乳酸菌细菌素的活性依赖于两个肽链。即任何一个肽链单独作用时无活性,只有两个肽链协同作用下才有抑菌活性,此类细菌素的代表为Lcn G[18]。

1.2.3 IIc类乳酸菌细菌素 IIc类乳酸菌细菌素是由前导肽带出胞外、具有热稳定的环形抑菌肽[19],与其他线性结构的乳酸菌细菌素相比,IIc类乳酸菌细菌素结构更稳定、耐热效力更高、对蛋白水解消化更稳定,抑菌谱更广。此类细菌素可以进一步分成两类:硫醇类和胱氨酸类细菌素。硫醇类细菌素具有两个半胱氨酸残基,而胱氨酸类细菌素只有一个半胱氨酸残基[19]。

1.2.4 IId、IIe和IIf类乳酸菌细菌素 IId类乳酸菌细菌素是没有合成N-末端前导序列或信号肽的一类细菌素,和其他II类的主要区别就在于此[12]。IIe类乳酸菌细菌素是由三种及以上不同的氨基酸肽类组成的多肽类细菌素,由较大的蛋白特异性降解形成的,如Aureocin A70[21]和Garvicin KS[22]。IIf类是热稳定性强的其他II类乳酸菌细菌素,这类细菌素主要由单链非类片球菌或其他细菌素的组合而成的,无相似序列。

1.3 III类乳酸菌细菌素

III类乳酸菌细菌素是由高分子量(>30 kDa)、热稳定性差的一类抑菌肽组成。这类细菌素可进一步分为两个亚类,其中IIIa类是溶菌性细菌素;IIIb类是非溶菌性细菌素[23-24]。IIIa类通常以酶切的方式裂解细菌的细胞壁,从而达到抑菌的目的。

1.4 IV类乳酸菌细菌素

IV类乳酸菌细菌素是一种带正电荷的疏水性大分子,与其他大分子形成大复合物的抑菌肽[24]。由于现有提纯手段的局限,未能将细菌素与复合大分子完全分离,所以把这类细菌素暂归为IV类细菌素。近年来,通过分离方法和全基因组测序技术结合,将一些原本属于IV类细菌素重新进行了划分,如植物乳杆菌素S(Plantaricin S)就是通过提纯后重新将其划归于IIb类的典型代表。

2 乳酸菌细菌素对革兰氏阳性菌抑菌机制

由于细菌素对革兰氏阳性菌有高效的抑制作用,而对革兰氏阴性菌、霉菌等可能无抑菌作用或效果不明显,因此大多数抑菌机理研究主要针对的是革兰氏阳性菌[32-33]。相关研究表明,乳酸菌细菌素主要通过与细胞膜受体特异性结合,促进细菌素在目标细菌的细胞膜上形成“核结构”,从而破坏细胞膜的完整性,造成目标细菌的质子动力的消散,从而导致目标细胞死亡[34-36]。

2.1 I类乳酸菌细菌素抑菌机制

I类乳酸菌细菌素的作用机制主要分为a、b两类。Ia类羊毛硫类细菌素是通过连接细胞膜上受体(lipid II),形成短暂的、非选择性跨膜孔通道,对质子动力产生干扰,从而影响氨基酸的转运,造成细胞内小分子流失[37]。目前Ia类细菌素中研究最透彻、应用最广泛的是nisin[38]。相关研究表明,nisin作用机制依赖于作用浓度:nisin浓度低时,通过抑制细胞壁合成起作用;nisin浓度高时,通过形成孔通道起作用[39]。Ib类细菌素基于它们的刚性和球状结构,通过静电吸引与细胞膜结合和/或通过与膜相关组分(lipid II)的特异性结合来抑制DNA/RNA/蛋白质或细胞膜合成[37-38]。

2.2 II类乳酸菌细菌素抑菌机制

2.2.1 IIa类乳酸菌细菌素 IIa类乳酸菌细菌素的N-端的保守序列YGNGVXXXC作为发夹结构，可被细胞膜上的蛋白受体特异识别,其带正电荷的亲水结构与目标细菌细胞膜上带负电的磷脂极性残基以静电力形式相结合,然后疏水性强的C-端与膜脂酰基作用,插入到膜内疏水区,聚集形成“核结构”[40-42]。“核结构”导致细胞内各种离子的渗漏,引起了膜内外离子失衡和磷酸盐的渗漏,从而导致细胞的死亡[43]。由此可见,C-末端是IIa类细菌素目标细胞特异性的决定区[44-45]。Diep等[46]研究发现IIa类乳酸菌细菌素主要是以目标细菌细胞膜上的man-PTS为作用受体。这个系统属于磷酸转移酶系统,主要负责糖的运输和磷酸化。man-PTS作为对接分子,导致细胞膜的通透性增加,质子动力的破坏和ATP的消耗,从而导致微生物细胞生物合成的停止。

2.2.2 IIb类乳酸菌细菌素 IIb类乳酸菌细菌素中E-型属于功能增强型。它的抑菌机制是通过连接lipid II受体,使膜通透性增加,细胞内的离子流失,质子动力势的耗散,但其活性不仅仅取决于质子动力势的耗散,还与ATP的多少有关。由于胞内磷酸盐的流失打破了ATP的电解平衡,致使可用的ATP的降低;而S-型是功能协同性,Kjos等[47]通过全基因组测序技术鉴定出S-型细菌素(Lcn G)的受体为UppP。UppP是一种高度保守的跨膜蛋白,能特异性地靶向乳酸乳球菌。细菌素在与UppP识别之后,细胞内的K+被释放,ATP水平降低。这表明细胞内K+的选择性流失造成质子动力势能的消耗,对依赖于ATP的反应造成了影响,从而抑制微生物生长繁殖[47]。

2.2.3 IIc、IId类乳酸菌细菌素 Gabrielsen等[48]研究发现乳酸乳球菌中的麦芽糖ABC转运蛋白是IIc类乳酸菌细菌素Garvicin ML的受体。IIc类乳酸菌细菌素作用方式也是通过与细胞膜上的特异性受体结合,增加膜渗透性,从而引起细胞内离子流失、膜电位的耗散,最终导致细胞死亡。IId类乳酸菌细菌素是没有合成N-末端前导序列或信号肽的一类细菌素。Uzelac等[49]发现Zn-依赖型金属肽酶对IId类乳酸菌细菌素(Lsb B)敏感。但LsbB与其他已知的IId类乳酸菌细菌素存在一定的差异,所以目前尚不清楚其他IId类乳酸菌细菌素对微生物的抑制机理。

2.3 III类乳酸菌细菌素抑菌机制

目前,III类乳酸菌细菌素发现的不多,它们的作用机制研究得也不透彻。相关研究显示[22],IIIa类乳酸菌细菌素可能是肽链内切酶肽,或者是其N-末端部分与参与细胞壁合成的内肽酶同源,C-末端部分负责识别靶细胞,通过酶促反应裂解目标细菌细胞壁,从而杀死细菌;IIIb类乳酸菌细菌素通过与磷酸烯醇丙酮酸依赖性葡萄糖和man-PTS系统结合而干扰葡萄糖转运或代谢,从而达到抑菌效果。

2.4 IV类乳酸菌细菌素抑菌机制

现在有关IV类乳酸菌细菌素抑菌机制研究较少,但这一类细菌素作用方式可能与I类、II类大多数细菌素类似,通过改变敏感细胞细胞膜的通透性,致使膜电位的消散、离子泄露,从而导致细胞死亡[50]。

3 乳酸菌细菌素在水产养殖及加工的应用

3.1 乳酸菌细菌素在水产养殖中的应用

乳酸菌细菌素在水产养殖中的应用主要是改良水质[51-53]。目前,水产养殖中抗生素的滥用已导致水体的微生态失衡,容易引起各种病害产生,促进部分有害微生物产生抗药性,这些都不利于水产养殖[54]。乳酸菌细菌素作为无毒、高效、无体内残留的抑菌物质,抑菌具有特异性,所以根据具体需要选用特定乳酸菌细菌素,可以避免引起养殖环境的微生态失衡[37]。李南充[55]在池塘养殖中直接加入乳酸菌细菌素或分泌细菌素的乳酸菌作为微生态制剂,发现这些微生态制剂不仅能明显改善水质状况,而且可以改善鱼肠道菌群结构,提高饲料吸收率。

在养殖鱼虾中主要是通过添加乳酸菌细菌素到饲料中来饲养鱼虾等水生动物[5,53-55]。主要作用在两方面[56]:一是对动物体内的致病微生物生长繁殖产生抑制,从而使其免疫能力提高,抗病能力加强;二是抑制饲料中有害微生物的生长繁殖。研究表明,乳酸菌细菌素添加到饲料中,能有效地抑制致病微生物生长,同时提高鱼类等动物的免疫力,减少疾病的发生[56-59]。Taoka等[60]将高浓度的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)4种菌掺入饲料喂养比目鱼,结果表明比目鱼的黏膜蛋白水平降低,溶菌酶活性显著提高,在被鳗弧菌感染后,饲喂混合饲料的比目鱼其存活率也得到了相应提高。这些研究表明,使用乳酸菌细菌素或者添加产细菌素的乳酸菌菌株,对维持养殖水体环境微生态平衡以及提高水产动物免疫力有一定的帮助。但目前乳酸菌细菌素的添加剂量及安全性仍处于研究阶段,这也限制了添加乳酸菌细菌素饲料的大批量生产,因此这还需要进一步研究以提供理论支持。

3.2 乳酸菌细菌素在水产品储藏的应用

在水产品储藏方面,众多研究表明乳酸菌细菌素对致病菌有一定的抑制作用,并且对水产品的感官品质、货架期延长等方面都有一定的改善作用[61-66]。Sudalayandi[67]通过在印度鲭鱼上接种不同的乳酸菌菌株(戊酸片球菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和瑞士乳杆菌),这些菌株能有效控制腐败菌和有机胺类产生,且在37 ℃贮藏条件下,延长了新鲜鱼货架期2 d。Kalschne等[68]利用2.0%乳酸与nisin应用于冷冻虾,发现能有效减少储存期间产品中的假单胞菌属(Pseudomonasspp.)以及产硫化氢的细菌。Katikou等[69]研究发现,在真空包装的虹鳟鱼片中添加能产抑菌物质的清酒乳杆菌 CECT 4808,储存在(4±0.5) ℃条件下20 d,处理后的虹鳟鱼片中常见微生物(肠杆菌、假单胞菌、产H2S细菌、酵母菌和霉菌)含量显著降低;气味以及化学指标(pH、挥发性总氮和脂质氧化)得到明显改善,接种了清酒乳杆菌的样品表现出良好的防腐能力,可延长保质期5 d,还表现出一定的抗氧化能力。Hwanhlem等[70]在8 ℃条件下,将分离纯化的乳酸菌素KT2W2L应用于气调包装的去皮熟制热带虾中,实验发现,乳酸菌素KT2W2L对24种食物腐败菌和食源性致病菌中的23种指示菌有高效的抑制作用;定期监测接种了该细菌素的虾制品在8 ℃储存条件下细菌的生长,结果发现7 d后,乳酸菌素KT2W2L仍能抑制热杀死环丝素(B.thermosphacta)和无害李斯特菌(L.innocua)的生长。

这些研究表明,将乳酸菌细菌素或产细菌素的乳酸菌作为生物防腐剂添加到水产制品中,可以有效提高产品安全性并延长货架期,同时抑制水产品中生物胺、氨和三甲胺氧化物的产生[71]。乳酸菌细菌素作为生物防腐剂有较大的发展空间,结合一些传统抑菌方法、栅栏技术和分子技术,能大大提高其应用价值,这为开发微量加工和无防腐剂的水产制品提供了方向。

4 结论与展望

本文通过介绍不同乳酸菌细菌素的现有研究成果,突出说明大部分乳酸菌细菌素的应用价值,相关研究结果表明使用提取的细菌素或产细菌素的乳酸菌在水产品中能够产生明显的抑菌效果,有很高的应用价值[72]。然而目前只有nisin被认可在食品中使用,这也说明乳酸菌细菌素的发展还需要更多的研究数据作为支撑(比如抑菌机理、细菌素毒力试验等),从而最大层面地发挥乳酸菌细菌素的价值。同时,在已研究的乳酸菌细菌素中,大部分乳酸菌细菌素的抑菌谱不如nisin广。这也意味着更多广谱乳酸菌细菌素需要得到筛选和分离。本文最后又重点介绍了乳酸菌细菌素的抑菌机理及其在水产品养殖、加工领域的研究趋势。这些研究结果也充分说明乳酸菌细菌素可以作为抗生素等药物替代品应用于水产品养殖、加工等领域。

随着抗生素及激素类等药物的大量使用,抗药性微生物的不断发现,这已成为养殖行业一个日益严峻的问题。乳酸菌细菌素作为一种新型、高效、绿色、安全的生物抑菌剂,在水产方面的应用具有广阔前景,但其在水产方面的应用还需解决的问题主要有:

a.乳酸菌细菌素应用的最佳条件:由于不同的乳酸菌细菌素在不同环境(pH、接种浓度、培养时间和营养来源等)下表现不同,而环境因素决定了其抑菌效果,所以更准确地了解特定乳酸菌细菌素最佳应用条件对其发展有促进作用;

b.在水产制品保鲜方面,乳酸菌细菌素结合其他技术(如超声辐照、微波加热及栅栏技术)协同效应尚未得到完全开发,因此乳酸菌细菌素与食品生态系统的相互作用也需进一步研究;

c.乳酸菌细菌素在由微生物引起的水产病害防治方面的研究比较少,这也是今后发展的一个方向。同时,需要注意的是,由于现有技术条件制约,乳酸菌细菌素产量较低、表达不够稳定、提取成本高、作用机理研究不够透彻等因素一定程度上限制了乳酸菌细菌素的应用。然而,随着科学技术的进步和对乳酸菌细菌素研究的深入,这种绿色安全、天然高效的抑菌剂将有广阔的市场前景,也将为水产领域发展提供更多的选择空间。