枣阳酸浆水中乳酸菌的可培养多样性 及其分离方式评价

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(1.湖北文理学院食品科学技术学院,鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳 441053; 2.枣阳市食品药品监督管理局,湖北襄阳 441299)

枣阳酸浆面是享誉湖北、闻名全国的小吃,其制作工艺入选湖北省非物质文化遗产,距今已有两百多年历史。枣阳酸浆面集酸、香、辣为一体,酸香可口、生津开胃,这与其原料酸浆水所起的作用密不可分。酸浆面的制作大致分为三步,制作酸浆水→制作臊子→制成面品。其中酸浆水的制作是使用烫芹菜或白菜与制面浆水进行发酵,每天用新鲜的面汤与老的酸浆水勾兑。在适宜的温度条件下,芹菜、白菜等蔬菜与制面浆水经过微生物的代谢作用,产生以乳酸为主的有机酸,形成了酸浆面的独特酸味[1-2]。然而,由于受到温度因素制约,酸浆面的制作一般只能在夏秋季节进行,不能实现全年制作。

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是指发酵糖类的主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称,并不是某一个特定的系统分类单元[3]。LAB对发酵食品品质具有多重作用:LAB产生的乳酸等有机酸能抑制有害菌的生长繁殖;LAB在食品发酵中通过酶的作用提高食品原料的营养价值,并合成酸、醇、酯类等多种芳香物质,对食品风味形成起到作用[4-6];另外LAB能通过代谢合成一些对人体有益的代谢物,如共轭亚油酸、γ-氨基丁酸、胞外多糖等[7-8];LAB产生的细菌素如乳酸链球菌素,对一些有害菌的生长与代谢起到抑制作用,在食品保鲜中得到广泛应用[9]。我国传统发酵食品种类众多,大多数含有种类丰富的LAB,其食用对人体具有一定的保健作用。目前对泡菜[10]、鲊广椒[11]、米酒[12]、黄酒[13]、发酵香肠[14]等发酵食品中LAB的研究报道较多。湖北琚湾镇酸浆面浆水中LAB相对微生物总量所占比例在90%以上[15]。但是目前对酸浆水中的微生物结构及其应用的研究较少,考虑到LAB在酸浆水形成中的作用,对酸浆水中LAB的分离与鉴定及在酸浆水制作中的初步应用研究就显得尤为必要。

为此,本研究从湖北省枣阳地区采集正在发酵中的酸浆水样品,采用变性梯度凝胶电泳(Denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)对酸浆水中的细菌群落结构进行初步解析,以此为基础使用多种培养方式对酸浆水中的LAB进行分离与鉴定,并对酸浆水中LAB分离的条件进行评价,以期能为酸浆水中LAB的分离提供方法指导,并为酸浆面的产业化提供LAB菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸浆水样品 采集自湖北省枣阳市(表1);甘油(分析纯)、葡萄糖(分析纯)、H2O2(分析纯)、NaCl(分析纯)、琼脂糖(生化试剂) 上海国药公司;MRS培养基、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨 北京奥博星公司;Axygen PCR清洁试剂盒 康宁生命科学吴江有限公司;DL2000 Marker、PCR buffer、rTaq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T克隆载体 宝生物工程(大连)有限公司;大肠杆菌(Escherichiacoli)top 10 实验室保存;引物(表2) 由天一辉远(武汉)生物科技有限公司合成。

表1 酸浆水样品采集信息Table 1 Sampling site of Suanjiangshui

表2 引物列表Table 2 Primers list

HR40-ⅡB2型生物安全柜 中国青岛海尔;QYC-2102C全温培养摇床 中国上海新苗;PTC-100 PCR仪 美国ABI公司;Fluor Chem FC3化学发光凝胶成像系统 美国ProteinSimple公司;SW-CJ-2D双人单面净化工作台 中国苏州安泰;XFS-280手提式压力蒸汽灭菌锅 中国浙江新丰;DG250厌氧工作站 英国Don Whitley公司;AG0025A 2.5 L厌氧罐、AN0025A 2.5 L厌氧袋 英国OXOID公司;变性梯度凝胶电泳仪 美国BioRad公司;BC-J160S CO2培养箱 中国上海博讯;土壤DNA提取试剂盒 美国OMIGA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酸浆水样品的DGGE分析 取5 mL酸浆水样品转移到5 mL离心管中,1000 r/min离心10 min。收集酸浆水样品中的含有菌体的悬浊物,然后使用土壤DNA提取试剂盒提取样品总DNA。以总DNA为模板,以引物517R与341-GC-F(表2)进行PCR扩增,得到LAB的16S rRNA序列的V3区。将扩增产物使用PCR产物清洁试剂盒进行纯化后,参照张振东等[19]的方法进行PCR-DGGE,变性梯度设置为30%～60%。电泳结束后,使用银染法对聚丙烯酰胺胶进行染色,使用扫描仪扫描聚丙烯酰胺胶,并将特征条带切下,装入无菌的1.5 mL离心管中,加入100 μL无菌纯水,4 ℃放置过夜后于8000 r/min离心5 min取上清液备用。

1.2.2 PCR产物的测序 取1.2.1中含聚丙烯酰胺凝胶条带的上清液为模板,使用引物341F与517R(表2)进行PCR扩增,使用PCR清洁试剂盒对PCR产物进行纯化。然后使用pMD18-T试剂盒,将纯化过的PCR产物连接到克隆载体pMD18-T上,转化到大肠杆菌感受态细胞。将转化后的菌体涂布于含有氨苄青霉素钠的LB平板上过夜培养,挑取单菌落使用引物M13F(-47)与RV-M进行验证,选取阳性克隆子送到南京金丝瑞生物科技公司测序。将测序结果在NCBI网站进行Blast比对,选取序列相似度≥99%的序列构建系统发育树。

1.2.3 LAB的分离与计数

1.2.3.1 增菌法分离与计数 取采集到的酸浆水样品,在超净工作台转移1 mL样品到含有15 mL无菌石蕊牛乳培养基中37 ℃培养24 h,对LAB进行增殖培养[20]。取10-4、10-5、10-63个梯度的稀释液涂布于含有1.5%碳酸钙的MRS固体培养基,在DG250厌氧工作站 37 ℃厌氧培养48 h。挑取具有透明圈的单菌落并划线,反复纯化3次。将纯化后的菌株进行革兰氏染色与过氧化氢酶实验,初步确认为LAB后,使用30%甘油保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3.2 非增菌法分离与计数 取酸浆水样品,进行10×的梯度稀释,取10-4、10-5、10-6梯度的稀释液,涂布于含有碳酸钙的MRS固体培养基,每个稀释度涂布5份。分别在下列五种条件下进行培养:SJSA法含有5%的CO2的培养箱培养;SJSB法厌氧工作站(10% H2,10% CO2,80% N2)培养;SJSC法厌氧罐中培养;SJSD法培养箱中好氧培养;SJSE法厌氧工作站(15% CO2,85% N2)培养。37 ℃培养48 h后,对在5种条件下的各梯度的MRS平板上具有透明圈的菌落进行计数,计算得到酸浆水中的LAB数量[21]。同时将所得单菌落按照1.2.3同样的方法进行纯化与保存。

1.2.4 LAB的鉴定 首先将纯化后保存在冰箱中的LAB连续活化3次,在MRS液体培养基中过夜培养收集LAB菌体,然后按照标准方法提取LAB基因组DNA[22],使用引物27F与1495R(表2)进行PCR扩增。获得PCR产物后,按照1.2.2的方法建克隆测序。将测序结果在NCBI进行Blast,选取序列相似度≥99%的序列构建系统发育树,进行系统发育关系分析。

1.3 数据处理

数据方差分析使用SPSS 18.0进行,图使用Origin 8.5绘制,图的处理使用Adobe Illustrator CS3完成,除了菌株的鉴定以外,样品采集的重复数n=3。

2 结果与分析

2.1 酸浆面浆水中LAB群落结构

对酸浆水样品中的细菌群落进行了DGGE分析。由图1可知,聚丙烯酰胺胶呈现出了丰富的条带,表明酸浆面浆水中的细菌种类丰富。此外,样品20#、31#、7#与12#聚集在一起,表明这4个样品中的LAB群落结构更为接近,然而它们在地域上并无联系。为探明酸浆水中的细菌具体组成,从聚丙烯酰胺凝胶上选取特征性条带进行了测序,并进行系统发育分析,结果见图2。

图1 基于16S rRNA基因V3区的 酸浆水样品细菌DGGE图谱Fig.1 DGGE profiles of the Suanjiangshui samples based on V3 region of 16S rRNA gene

由图2可知,DGGE凝胶中条带R2与R9序列属于德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii),条带R3、R4、R6、R7、R8序列与发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)模式菌相似度最高,超过了99%,归为发酵乳杆菌。条带R1、R5序列与多个模式种序列相似度均超过99%,无法进行准确的鉴定。R1是6个浆水样品的共有条带,表明它代表的LAB是酸浆面浆水样品的共有菌群,而R5则在样品32#中亮度最高,显示它代表的LAB是该样品的优势LAB,而在其他样品中则含量较低,并非其他样品的优势菌株。聚丙烯酰胺凝胶条带经过测序,并未获得LAB之外的细菌序列,由此可知,酸浆水中的细菌主要由LAB组成,且以乳杆菌属(Lactobacillus)的德式乳杆菌及发酵乳杆菌为主。

图2 基于16S rRNA基因V3区的酸浆面浆水LAB系统发育分析Fig.2 Phylogenetic tree of LAB from Suanjiangshui based on V3 rigeon of 16S rRNA gene

周书楠等[15]使用高通量测序手段,对湖北省枣阳市酸浆面浆水中的细菌多样性进行了解析,乳杆菌属(Lactobacillus)LAB是酸浆水中的优势细菌微生物,其相对含量高达99.72%,同时基于样品的核心操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTU)系统发育分析表明,

在种的水平上乳杆菌属LAB进一步可分为德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌等LAB。此外,张晓辉等[23]研究发现陕西省西安与天水的浆水中LAB同样以乳杆菌属为主,相对含量占70%以上,另外还含有链球菌属、克雷伯氏菌属、不动杆菌属等共有菌属。通过PCR-DGGE法对酸浆水中LAB的解析中,由于条带R1序列与多个LAB模式种的相似度均较高,而通过与周等[15]的研究结果相比较,R1条带很有可能代表了嗜淀粉乳杆菌。

2.2 酸浆水中LAB计数

使用MRS培养基通过平板计数法对采集到的六个浆水样品中的LAB进行了计数。结果见图3,样品间酸浆水中LAB的数量差异较大,同时从市区采集到的12#、20#与32#样品中LAB数量远远超过其他来源的两个样品,其中样品12#与20#的LAB含量最高,能达到1.7×108～2.5×108cfu/mL,而7#、31#和34#样品分别来自枣阳市琚湾镇、吴店镇与七方镇,样品中的LAB数量较低,其中样品31#的LAB数量仅为5.2×106cfu/mL,

图3 酸浆水中的LAB浓度Fig.3 The concentration of LAB of Suanjiangshui注:A:含有5%的CO2的培养箱培养;B:厌氧工作站 (10% H2,10%CO2,80%N2)培养;C:厌氧罐中培养; D;培养箱中好氧培养;E:厌氧工作站 (15% CO2,85% N2)培养,表3同。

最高与最低之间相差高达2个数量级。另外,通过非增菌法的五种方式对酸浆水中LAB进行富集培养,发现在好氧培养条件对LAB的分离效果最差。

2.3 酸浆水中LAB的鉴定

根据菌落形态特征,对具有透明圈、过氧化氢酶阴性的菌株进行纯化(图4),通过16S rRNA基因序列分析,共获得90株LAB,基于菌株的16S rRNA基因序列的系统发育分析(图5),这些均属于乳杆菌属,分为6个种,分别是:德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)与玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)。总体上来说,通过可培养法(增菌法与非增菌法)分离得到的90株菌中,属于发酵乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌的菌株数量最多,分别为40、22、14株,分别占总分离菌株的48.89%、24.44%、15.56%;德式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌与玉米乳杆菌较少,分别为7、6、1株,仅占总分离菌株为7.78%、6.67%、1.11%。

表3 LAB分离结果Table 3 The results of isolation of LAB

图4 部分LAB菌落形态Fig.4 Colony morphology of part lactic acid bacteria注：A～B:增菌法分离得到;C～F：非增菌法分离得到。

图5 不同方式分离的LAB系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of LAB isolated by different methods注:SJSA 5% CO2的培养箱培养;SJSB厌氧工作站(10% H2,10% CO2,80% N2)培养;SJSC厌氧罐培养; SJSD培养箱中好氧培养;SJSE厌氧工作站(15%CO2,85%N2)培养;SJS增菌法,具体见实验方法1.2.3。

研究表明,通过可培养法与DGGE得到结果并不一致。DGGE结果显示,德式乳杆菌与发酵乳杆菌是酸浆面浆水中的优势菌。然而通过可培养法(增菌法与非增菌法)仅得到了7株德式乳杆菌,占总分离菌株的7.78%,并未分离到嗜淀粉乳杆菌,因此二者结果并不一致,且未分离得到条带R1代表的LAB。另外,通过可培养法分离到的鼠李糖乳杆菌与玉米乳杆菌并未在DGGE条带中出现,显示可培养法由于培养基成分及培养条件原因,可以对一些菌具有富集作用,从而能对食品环境中的非优势菌进行分离。

孟宪刚等[24]从陕西省的浆水中获得的细菌有乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)等5个属。与陕西来源的浆水相比,琚湾来源的酸浆水中LAB种类明显较少,这可能与酸浆水的制作工艺有关。枣阳地区酸浆水的制作,会在每天早上加入开水,能杀死所富集的部分细菌,导致酸浆水中细菌种类的减少,而酸浆水中的发酵乳杆菌、植物乳杆菌与干酪乳杆菌较为适应酸浆水的环境,且耐较低的pH环境,能够快速生长占据群落的优势。

目前已报道的用于厌氧或兼性厌氧的细菌分离条件有多种:在厌氧工作站中在3种混合气体[25-26]或者2种混合气体[27]的厌氧条件下培养,在厌氧罐中使用厌氧产气袋造成的厌氧条件下培养[28],也有在含有5%的CO2培养箱中对LAB进行培养[29-30]。本研究中的6种培养方式对发酵乳杆菌与植物乳杆菌均具有较好的分离效果;SJSB、SJSC、SJSD、SJSE培养方案与增菌法都能分离得到德式乳杆菌,SJSB与富集法的分离效果最好;SJSA、SJSB、SJSC、SJSE与增菌法均分离到了酸浆水中的干酪乳杆菌,而SJSB与SJSE的分离效果最好;SJSA、SJSB、SJSC与增菌法菌对鼠李糖乳杆菌的分离效果相近;对于玉米乳杆菌,仅通过SJSC法获得了该菌。

3 结论

通过DGGE法对枣阳酸浆水中的微生物多样性进行了研究,酸浆水中细菌主要有乳杆菌属乳酸菌,有德式乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌与嗜淀粉乳杆菌等。通过6种不同培养方式,从酸浆面浆水中分离得到了90株LAB,经过鉴定,它们分别属于德氏乳杆菌、发酵乳杆菌,干酪乳杆菌,植物乳杆菌、,鼠李糖乳杆菌、玉米乳杆菌及嗜淀粉乳杆菌,其中分离到的植物乳杆菌与发酵乳杆菌所占比例最大。

综合来看,增菌法、厌氧工作站(10% H2,10% CO2,80% N2)法、厌氧罐分离法具有较好的分离效果,而5%的CO2条件与好氧培养则效果较差。本研究中使用石蕊牛乳增菌法,共获得12株LAB。16S rRNA系统发育分析表明,该法对酸浆水中的发酵乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌均具有较好的富集效果。鉴于可培养方法对培养基的依赖性,后续可对培养基进行改进,以获得酸浆水中被DGGE法检测到却在本实验中未分离到的LAB,以丰富应用于食品的LAB资源。