四种检验水中粪大肠菌群标准方法的对比研究

张会强，徐锦岳,张秦铭,马文鹏,王 斐,白 昭

(1.陕西省环境监测中心站，陕西 西安 710054; 2.大连理工大学生命与医药学院，辽宁 盘锦 124221)

粪大肠菌群是在44.5℃温度下能生长并发酵乳糖产酸，产气，需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，主要来自粪便。粪大肠菌群又称耐热大肠菌群，可以指示水体是否遭受粪便污染，直接指示生活污水的污染，间接反映肠道致病菌的污染风险，是水质检验中非常重要的卫生指标。

目前，国内测定水中粪大肠菌群的标准分析方法有多管发酵法[1]、滤膜法[1]、纸片快速法[2]和酶底物法[3]。多管发酵法早在1985年就列入了《生活饮用水标准检验方法》(GB 5750-85)，至今已经沿用了三十多年，是行业内公认的粪大肠菌群测定的经典方法，卫生、水利、环保等行业均有多管发酵法的方法标准。美国公共卫生协会(APHA)出版的《水和废水标准检验方法》(20版)中方法9221E也采用的是多管发酵法[4]；滤膜法采用直接计数特征菌落的方式，不同于其它三种方法采用MPN法计数，其应用广泛性仅次于多管发酵法，美国APHA方法9222D[4]和ISO9308-1:2014[5]采用的是滤膜法；纸片快速法在西方发达国家采用较少，主要在一些发展中国家使用，环保部在2015年发布了测定水中粪大肠菌群的纸片快速法[2]；酶底物法利用粪大肠菌群在邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷培养基上培养产生β-D-半乳糖苷酶，该酶可以分解色源底物释放出黄色的邻硝基苯酚，通过颜色变化定性，MPN法定量。我国没有酶底物法测定粪大肠菌群的现行国家和行业标准，美国APHA方法9221 E[4]、ISO 9380-2:2012[6]和GB5750.12-2006[7]均将酶底物法列入标准，但仅限测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌。2018年4月陕西省质量技术监督局发布了酶底物法测定粪大肠菌群的地方标准[3]，填补了酶底物法测定粪大肠菌群的标准方法空白。

现参照环保行业标准HJ/T347-2007、HJ 755-2015和DB61/T 1138-2018，对多管发酵法、滤膜法、纸片快速法和酶底物法分别从检出限、方法操作、准确度、方法间一致性进行了对比研究。

1 仪器、试剂和耗材

GNP-9270隔水式恒温培养箱(37℃，上海精宏实验设备有限公司)；GHP-9160隔水式恒温培养箱(44.5℃，上海一恒科学仪器有限公司)；LDZX-50KBS不锈钢立式灭菌器(上海申安医疗器械厂)；Whatman MBSI微生物过滤系统(美国GE公司)；LK-2010A型程控定量封口机(西安立科环保科技有限公司)；酶底物法试剂、100mL无菌定量瓶、51孔和97孔定量检测盘(均购自西安立科环保科技有限公司)；定量菌株Quanti-Cult Plus(美国ThermoFisher公司)；大肠菌群检验纸片(广州达元绿洲生化科技有限公司)；乳糖蛋白胨、EC肉汤、MFC培养基(北京陆桥技术股份有限公司)；移液器(德国Eppendorf)；实验用水为经121℃高压蒸汽灭菌20min后的无菌水；枪头等其他耗材。微生物检测数据为偏态分布[8]，按照其统计分析要求，以下所有检测数据均经对数(以10为底)转换后，再进行分析计算。

2 方法对比

2.1 方法检出限

方法检出限取决于取样量和最低检出值，MPN法的检出限为各个稀释管为阴性时对应的MPN值。多管发酵法的接种量为300mL时，查HJ/T347-2007中表 2 可得该方法的检出限为3MPN/L[1]；滤膜法为直接菌落计数法，当取1L水样时方法的检出限为0cfu/L；纸片快速法查HJ 755-2015中附录B表可得该方法的检出限为20MPN/L[2]；酶底物法的接种量为300mL时，查DB61/T 1138-2018中表B.1该方法的检出限为3MPN/L[3]。

2.2 方法操作

多管发酵法需要配制乳糖蛋白胨培养基等准备工作，初发酵和复发酵试验，检测时间>72h；滤膜法需要配制MFC培养基等准备工作，初发酵试验，必要时需要复发酵试验确认，检测时间>48h；纸片快速法直接接种商品化纸片，无须配制培养基，检测时间>24h；酶底物法采用商品化培养基，无须配制培养基，检测时间>24h。

2.3 标准定量菌株实验

取Quanti-Cult Plus定量菌株R4717085(真值为66cfu/0.1mL菌液)按照说明书制备成稀释菌液。分别用多管发酵法、滤膜法、纸片快速法和酶底物法取0.1mL菌液进行检测，多管发酵法和纸片快速法取0.1mL菌液加入到9.9mL无菌水中，然后接种5份1.0mL、5份0.1mL、5份0.01mL，结果计算见公式(1)；滤膜法取0.1mL菌液加入到9.9mL无菌水中，旋涡振匀后进行过滤，计数阳性菌落为检测结果；酶底物法取0.1mL菌液加入100mL无菌定量瓶中，无菌水定容后用51孔定量检测盘检验，查51孔MPN表计数结果。每种方法做3个平行样。

(1)

式中：C-0.1mL菌液中粪大肠菌群的数量，MPN/0.1mL；MPN-查15管MPN表所得的MPN值；接种量最大的一管(或纸片)体积是1.0mL，先换算成100mL中的MPN浓度，再折算成10mL稀释菌液中浓度即0.1mL菌液的MPN值。

表1 四中方法标准定量菌株检测数据汇总表

2.4 相关性比较

实验选取了55个不同来源的水样同时用多管发酵法、滤膜法、纸片快速法和酶底物法在相同的取样量(55.5mL或5.55mL)和相同培养条件下进行检测，将酶底物法、纸片快速法和滤膜法的检测结果分别与经典的多管发酵法进行相关性分析(见图1～图3)。

图1 多管发酵法与酶底物法测定粪大肠菌群的相关性分析

图2 多管发酵法与纸片快速法测定粪大肠菌群的相关性分析

图3 多管发酵法与滤膜法测定粪大肠菌群的相关性分析

采用SPSS18软件进行配对t检验。多管发酵法分别与酶底物法配对t检验的p值为0.178；多管发酵法分别与纸片快速法配对t检验的p值为0.450；多管发酵法分别与滤膜法配对t检验的p值为0.012。

3 结果与讨论

从方法的检出限来看，滤膜法不受取样量限制(只要水样不堵塞滤膜)，检出限最低；多管发酵法和酶底物法的最低检出限同为3MPN/L；纸片快速法的检出限为20MPN/L。

从实验操作来看，多管发酵法和滤膜法均需要配制培养基，而且进行复发酵，操作繁琐；纸片快速法和酶底物法无需配制培养基，操作简单。因此，多管发酵法工作量大，耗费时间最长；滤膜法操作强度和耗费时间略低于多管发酵法；纸片快速法和酶底物法操作简便，更适用于大量样品的快速检验。

从定量菌株检测结果来看，多管发酵法的相对误差范围为-7.1%～16.2%，最终值为4.5%±11.6%；纸片快速法的相对误差范围为-16.6%～4.3%，最终值为-6.1%±10.4%；滤膜法的相对误差范围为-13.2%～4.9%，最终值为-4.2%±9.0%；酶底物法的相对误差范围为2.1%～6.8%，最终值为4.4%±2.4%。因此，酶底物法的准确度均优于其它三种方法；酶底物法平行样的相对标准偏差为2.6%，精密度也优于其它三种方法。

从相关性比较来看，多管发酵法分别与酶底物法配对t检验的p值=0.178>0.05，方法间无显著性差异；多管发酵法分别与纸片快速法配对t检验的p值=0.450>0.05，方法间无显著性差异；多管发酵法分别与滤膜法配对t检验的p值=0.012<0.05，存在显著性差异。因为纸片快速法和多管发酵法均采用15管MPN法定量，而酶底物法采用51孔或97孔MPN法定量，所以纸片快速法与多管发酵法的相关性更好(0.450>0.178)。滤膜法采用直接菌落计数(cfu)，采用该方法时须与多管发酵法的数据进行可比性验证。

4 结语

综上所述，多管发酵法、滤膜法、纸片快速法和酶底物法在检出限、实验操作、准确性和精密度、检测时间、适用范围等(见表2)均存在差异。多管发酵法和纸片快速法已经列为《国家地表水环境质量监测网监测任务作业指导书》(试行)的指定方法。多文献报道酶底物法适用于当前环境监测工作迫切需要[9-10]，在实际工作中应根据上述方法的特点选择合适的分析方法。

表2 四中测定水中粪大肠菌群方法的对比汇总