牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞增殖和侵袭影响研究*

李 晨，程联智，洪国勇，潘发福，周荣平，贾惊宇，顾玉荣

1.南昌大学第二附属医院骨科(南昌330000)；2.江西省婺源县人民医院骨科(婺源 333200 )

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是骨恶性肿瘤中最常见且高度恶性的肿瘤之一，严重危害儿童和青少年的身体健康。在该年龄段癌症致死排名中，骨肉瘤高居第三位。研究表明骨肉瘤最常见转移器官是肺，患者5年生存率很低。目前对于骨肉瘤治疗采用综合疗法，常规化疗治疗骨肉瘤副作用大，效果仍不佳。寻找新的方向突破尤其是中医领域是研究热点。

牛蒡子苷元(Arctigenin，ARG)是中医药牛蒡子中的主要有效活性成分。目前多项研究表明牛蒡子苷元具有抗肿瘤、增强免疫力、抗病毒等作用。牛蒡子苷元在肝癌、直肠癌、结肠癌等肿瘤中已经被证实具有抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和诱导肿瘤细胞凋亡等作用[1-4]。但是目前在国内外对于牛蒡子苷元治疗骨肉瘤研究少，本研究为研究牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的影响，为其治疗骨肉瘤提供临床理论依据，现报道如下。

材料与方法

1 材 料 人骨肉瘤细胞系MG63(武汉大学中国典型生物保藏中心)；牛蒡子苷元(美国Sigma公司)；RPMI-1640培养液(美国Sigma公司)；Matrigel(美国Sigma公司)；MTT(美国Sigma公司)；二甲基亚砜(美国Sigma公司)；PBS、Annexin V和PI(鼎国生物试剂有限公司)；细胞培养箱(英国Galaxy公司)；Wallace 1420酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)；SW-CJ-IF超净工作台(苏州净化设备公司)；CSX41倒置显微镜(日本尼康公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)。

2 骨肉瘤细胞培养与分组 将人骨肉瘤细胞系MG63培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，37 ℃、5% CO2培养箱内常规传代培养，取对数生长期的MG63细胞用胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/ml。将牛蒡子苷元设置成不同浓度分组(A-E组)用于实验(分别为10、20、40、80和100 μmol/L)。

3 细胞增殖实验(MTT法) 取100 μl骨肉瘤细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，放置于CO2培养箱中，37 ℃，培养24 h，观察细胞完全贴壁后加入不同浓度的牛蒡子苷元干预，设置阴性对照组和空白组，阴性对照组中不加药物牛蒡子苷元只加入等量的生长液，而空白组中不加细胞加入等量的牛蒡子苷元药物。培养时间分别为24、48、72 h。待药物作用结束后，加入 MTT溶液20 μl(终浓度为5 mg/ml)，置于37 ℃ CO2培养箱中反应后弃上清液，加入150 μl DMSO，避光条件下缓慢震荡10 min，观察结晶物完全溶解后。用酶联免疫检测仪测定其吸光度(OD)值，实验重复3次。

4 细胞侵袭实验( Transwell法) MG63细胞经过不同浓度分组(A-E组)的牛蒡子苷元作用干预48 h后，胰蛋白酶消化细胞，加入培养基悬浮细胞，调整细胞浓度为3×103个/ml细胞悬液，加入到提前5 h用Matrigel包被过的Transwell细胞培养小室中，每小室100 μl，设3个平行孔，在Transwell小室下部加入培养基中，于温箱内孵育48 h后将小室取出，滤膜用甲醇固定5 min。弃去固定液，加适量苏木精染色10～30min。用棉签擦掉未穿过膜的细胞(滤膜上层细胞)。随机选取5个视野计数，取平均数，穿膜细胞数越多表示侵袭能力越强。于显微镜下计数侵袭细胞数。

5 流式细胞仪检测细胞凋亡 取培养处理好的MG-63细胞调整细胞浓度为2×105个/孔，接种于6孔细胞培养板中，每孔加入细胞生长液2 ml，细胞培养箱中培养细胞24 h后，观察细胞完全贴壁，倒掉细胞生长液，分别在MG-63细胞中加不同浓度分组(A-E组)的牛蒡子苷元的含药培养基，每孔中加入细胞生长液体积为2 ml。同时设对照组，对照组MG-63细胞中不加牛蒡子苷元，加入等量的DMSO溶液，继续孵育48 h，弃去含药培养基，加入PBS洗涤后，胰蛋白酶消化细胞，2 000 rpm、5 min离心，加入PBS重悬，调整每孔中细胞数量大约为1×106个，继续2000 rpm、5 min离心，收集细胞，在每组细胞中加入500 μl的结合缓冲液，混合均匀，重悬细胞。加入5 μl Annexin V，再加入5 μl PI混合，室温下孵育反应10 min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。凋亡率=凋亡细胞数/(凋亡细胞数+正常细胞数)。实验重复3次。

6 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件统计分析所得数据，计量资料行单因素方差分析，P<0.05差异有统计学意义。

结果

1 牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞MG-63增殖影响 检测不同浓度牛蒡子苷元(10、20、40、80、100 μmol/L)对人骨肉瘤细胞MG-63增殖影响作用(图1)。随着牛蒡子苷元作用时间延长(0、24、48、72 h)，MG-63细胞逐步增殖，但牛蒡子苷元药物的浓度越高，骨肉瘤肿瘤细胞增殖抑制越明显，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞MG-63增殖影响

2 牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞MG-63侵袭影响 MG63细胞经过不同浓度分组(10、20、40、80和100 μmol/L)的牛蒡子苷元作用干预48 h后，利用 Transwell小室测定其侵袭性。结果显示经过0、10、20、40、80和100 μmol/L浓度的牛蒡子苷元作用后，骨肉瘤细胞侵袭力分别为：867±19.47、634.67±11.24、571.33±14.19、441.33±18.77、245.67±9.07、136.33±11.50。数据分析说明浓度为10、20、40、80和100 μmol/L的牛蒡子苷元与对照组(0 μmol/L)具有显著性差异(P<0.05)，提示牛蒡子苷元可以减弱骨肉瘤细胞的侵袭性，浓度越高，效果越明显(图2)。

图2 牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞MG-63侵袭影响

3 牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞MG-63凋亡影响 骨肉瘤MG-63细胞中加不同浓度(0、10、20、40、80和100 μmol/L)的牛蒡子苷元作用48 h后，经过染色，凋亡率随药物浓度增加而增加，分别为0.13±0.02、0.29±0.01、0.43±0.03、0.64±0.01、0.85±0.01、0.93±0.01。六组相互比较，均提示差异具有统计学意义(P<0.05)。说明牛蒡子苷元可以促进骨肉瘤细胞的凋亡，浓度越高，凋亡越多(图3)。

图3 流式细胞仪检测骨肉瘤细胞凋亡

讨 论

骨肉瘤(Osteosarcoma)是恶性程度高的骨原发性肿瘤，其特点是瘤细胞直接形成骨样组织。骨肉瘤恶性程度高，预后极差，可于数月内出现肺部转移，5年存活率低。虽然目前最新采取的治疗方式多为新辅助化疗+手术治疗为主，主要以手术联合新辅助化疗为主,基因治疗、分子靶向治疗、免疫治疗等的研究取得了一定进展,仍有待于进一步的基础研究及临床实践论证。新辅助化疗缩小瘤体、消灭微小病灶,为手术彻底切除提供保障,减少肿瘤复发及转移[5], 但患者存活率仍然不乐观。而且化疗药物对于骨肉瘤细胞和人体正常细胞均有明显的杀伤作用，不良反应较大。

中国中医药博大精深，抗肿瘤药物层出不穷[6-7]。牛蒡子苷元是从菊科植物牛蒡属牛蒡子中提取的木脂素类化合物[8-10]。初期被用于抗炎[1，12]，后期发现牛蒡子苷元可以调节免疫调节、抑制许多种肿瘤的作用[1-4]。目前发现其作用机制为阻断肿瘤细胞周期中G0/G1期，或在G2/M期抑制细胞增殖[13-16]。

本实验结果显示，牛蒡子苷元干预骨肉瘤细胞系后，增殖明显受到抑制，侵袭性降低，凋亡水平明显增高，具有统计学差异。牛蒡子苷元对骨肉瘤细胞的抑制呈现浓度依赖性和时间依赖性，差异具有统计学意义。而且通过流式细胞技术分析的结果与MTT法的细胞增值实验一致，说明牛蒡子苷元有抗骨肉瘤作用，值得进一步研究。

目前关于牛蒡子苷元对人骨肉瘤细胞影响的研究较少，本研究结果对牛蒡子苷元抗骨肉瘤的研究有一定的帮助，但需要进一步研究其抗肿瘤的机理通路并在动物实验中验证。