基于对SGC-7901细胞Survivin、Bcl-2基因的调控探讨益气化瘀散结方影响胃癌细胞增殖凋亡的作用机制*

裴俊文，孙太振，蒋立峰

郑州大学附属肿瘤医院(河南省肿瘤医院)(郑州 450008)

胃癌则是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，也是全球第二大癌症相关病死原因[1-3]。在我国各种恶性肿瘤中，胃癌的发病率和病死率均居第一位，且发病率和死亡率呈现上升趋势，每年新发病例40万左右，占世界发病总例数的42%，是当前危害国民身体健康的重大疾病之一[4-5]。我国胃癌早期诊断率较低，大多数胃癌被诊断时已为晚期，尽管经过综合性的治疗，其总体预后仍较差。中医药在改善胃癌等肿瘤患者临床症状、提高生活质量、实现带瘤生存以及改善化疗毒副作用等方面的作用已逐渐得到公认，因此中医药治疗胃癌的作用研究意义重大。细胞增殖和凋亡失衡是肿瘤最明显的特征，表现为细胞正常的凋亡程序受到抑制，而增殖能力增强，胃癌的发生、发展与细胞凋亡调控机制异常密切相关[6]。本研究通过体外实验观察我科治疗胃癌的有效验方益气化瘀散结方对胃癌SGC-7901细胞增殖凋亡的影响，并通过益气化瘀散结方干预后凋亡相关蛋白Survivin、Bcl-2的表达变化探讨其相关作用机制。

材料与方法

1 实验材料 人胃癌细胞株SGC-7901由河南中医药大学第一附属医院实验室惠赠。益气化瘀散结方由党参、白术、黄芪、当归、川芎、桃仁、红花、夏枯草、虫、炙甘草组成。RPMI-1640 细胞培养基、胎牛血清，Hyclone 公司；噻唑兰(MTT)、二甲基亚砜( DMSO)，0.25%胰酶，Solarbio公司；Survivin、Bcl-2一抗，CST公司；β-actin一抗、牛抗鼠二抗，Santa Cruz公司；RNA提取试剂盒，TIANGEN公司；逆转录试剂盒、SYBR reen I荧光定量PCR试剂盒，Vazyme公司。

2 细胞培养及耐药诱导 SGC-7901细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液中，置于37 ℃、5% CO2的CO2孵箱中培养。

3 益气化瘀散结方含药血清制备 SPF级健康雄性SD大鼠20只，体质量(230±20)g，体重180～220 g，按体质量随机分为益气化瘀散结方组和空白对照组，各10只。益气化瘀散结方给药剂量按照成人临床等效剂量换算灌胃，空白对照组灌胃等量蒸馏水。2次/d，连续4 d。最后1次灌胃1 h后用水合氯醛麻醉，采用无抗凝剂真空采血管从腹主动脉取血。室温静置2 h，3500 rpm 离心20 min，同组分离的血清一块混匀，经恒温水浴56℃灭活30 min，在超净台用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，分装，放入-80℃冰箱中保存备用。

4 细胞分组与给药 培养SGC-7901细胞，待细胞生长至对数期时用胰酶消化细胞，按一定浓度种至培养板中，细胞生长到80%融合后用无血清培养基培养12 h，将细胞同步化并随机分为四组：空白血清组、5%益气化瘀散结方组、10%益气化瘀散结方组、20%益气化瘀散结方组，培养一定时间后，收集细胞，进行后续试验。

5 CCK8法检测细胞增殖 SGC-7901细胞按照每孔5×103/ 孔接种到 96 孔板中，按照不同分组分别培养12 h、24 h、48 h、72 h后，CCK8法检测各实验组细胞的增殖率。采用酶标仪450 nm处测定光吸收(OD)值。

6 流式细胞术检测细胞凋亡率 SGC-7901细胞以5×105/ml浓度种96孔板培养24 h后1700r/min离心，弃培养基加入空白鼠血清及不同浓度的益气化瘀散结方含药血清培养基再培养48 h，收集细胞悬液100 μl于流式管中加入 5 μl Annexin V/FITC 和 10 μ的PI溶液，混匀后于室温避光孵育 15 min。用BD FACSCalibur流式细胞仪获取数据，Flowjo软件分析不同浓度含药血清干预的SGC-7901细胞的凋亡率。

7 Western-blot 技术检测各组细胞Survivin、Bcl-2的蛋白表达 消化收集各组细胞，PBS 1000转5 min离心，洗涤细胞2次，用RIPA裂解液(按1%的比例加PMSF)裂解细胞，10000g离心10 min提取细胞总蛋白。按照BCA法进行蛋白定量，将各蛋白样品调整至一致浓度。根据实验取适量蛋白样品，按照4∶1的比例加入5×SDS上样缓冲液，混匀后95 ℃加热3～5 min，使蛋白变性。将变性的蛋白加入制好的SDS凝胶孔中，采用恒压法进行电泳，浓缩胶100 V、分离胶80 V。电泳结束后，取出凝胶，确定目的条带的大致位置后，将多余的凝胶切除，裁取比目的凝胶稍大的PVDF膜，甲醇中浸泡5 min，然后按照胶、滤纸、膜的顺序，其中胶在负极(黑的一面)，于4℃环境下200 mA恒流转膜2 h。转膜完后取出PVDF膜，于5% 脱脂奶粉中，摇床封闭1～2 h。用封闭液稀释抗体(Survivin、Bcl-2、β-actin，稀释比例参考抗体说明书)，膜在抗体中4 ℃孵育过夜。弃一抗，TBST洗膜3次，每次5 min，然后加入稀释后的二抗于室温下孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，加ECL发光液，室温孵育3～5 min，用Western Blot 扫膜仪采集膜上的蛋白条带，并分析计算各条带的灰度值。

8 Real time PCR技术检测细胞Survivin、Bcl-2 mRNA的表达 根据 Gen Bank 靶基因序列设计引物，以 GAPDH 为内参，均由上海生工生物工程技术有限公司合成。GAPDH序列：上游TCGGAGTCAACGGATTTGGT，下游TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC，产物181bp。Survivin序列：上游AGGACCACCGCATCTCTACA，下游TGTTCCTCTATGGGGTCGTCA，产物187bp。Bcl-2 序列：上游AGGCTGGGATGCCTTTGTGG，下游TTTGTTTGGGGCAGGCATGT，产物167 bp。消化收集各组细胞，提取总 RNA，反转录，然后采用SYBR-Green 荧光定量试剂盒，罗氏 480 实时荧光定量 PCR仪检测各组细胞Survivin、Bcl-2 mRNA表达，采用 2-△△Ct法进行数据分析。

结果

1 益气化瘀散结方含药血清对SGC-7901细胞增殖的影响 见表1。与空白组比较，5%、10%、20%益气化瘀散结方含药血清均能不同程度的抑制SGC-7901的增殖，其中以10%、20%含药血清抑制作用明显(P<0.05)；各时间点比较，随着时间延长，益气化瘀散结方含药血清对SGC-7901细胞增殖的抑制作用逐渐增强，48h达到高峰，至72h已经下降。

2 益气化瘀散结方含药血清对SGC-7901 细胞凋亡的影响 见表2。结果显示，5%、10%、20%益气化瘀散结方含药血清干预后，SGC-7901细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率均有不同程度的增加，与空白对照组比较以10%、20%含药血清组差异显著(P<0.05)。

表1 不同浓度益气化瘀散结方含药血清对SGC-7901细胞增殖的抑制率比较(%)

注：与5%含药血清组比较，△P<0.05

表2 各组细胞凋亡情况比较(%)

注：与空白血清组比较，△P<0.05；与5%含药血清组比较，▲P<0.05

3 益气化瘀散结方对SGC-7901细胞Survivin、Bcl-2蛋白表达的影响 利用β-actin作为内参计算Survivin、Bcl-2蛋白在各组细胞中的相对表达量。结果显示，与空白血清组比较，5%、10%、20%益气化瘀散结方含药血清均能下调Survivin、Bcl-2蛋白的表达(P<0.05)；不同浓度益气化瘀散结方含药血清组间比较，10%、20%含药血清组Survivin、Bcl-2蛋白相对表达量明显高于5%含药血清组(P<0.05)。见表3、图1。

4 益气化瘀散结方对SGC-7901细胞Survivin、Bcl-2 mRNA表达的影响 以GAPDH作为内参基因，采用2-△△Ct法分析比较各组细胞目的基因变化。结果显示，与空白血清组比较，5%、10%、20%益气化瘀散结方含药血清均能下调Survivin、Bcl-2 mRNA的表达(P<0.05)；不同浓度益气化瘀散结方含药血清组间比较，10%、20%含药血清组Survivin、Bcl-2 mRNA相对表达量明显高于5%含药血清组(P<0.05)。见表4。

表3 各组细胞Survivin、Bcl-2蛋白表达比较

注：与空白血清组比较，△P<0.05；与5%含药血清组比较，▲P<0.05

表4 各组细胞Survivin、Bcl-2 mRNA表达

注：与空白血清组比较，△P<0.05；与5%含药血清组比较，▲P<0.05

1:空白血清组；2:5%含药血清组；3:10%含药血清组；4:20%含药血清组

图1 各组细胞Survivin、Bcl-2蛋白免疫印迹条带图

讨论

Survivin、Bcl-2基因是与调控细胞增殖凋亡的关键蛋白，其表达异常与肿瘤的发生、发展密切相关。Survivin蛋白归属凋亡抑制蛋白( IAP) 家族，是迄今为止发现的凋亡抑制作用最强的蛋白因子，能够抑制细胞凋亡、维持细胞有丝分裂[7]。研究发现，Survivin蛋白在正常终末分化组织细胞中表达量极低，但在肿瘤组织中异常表达，与肿瘤发生发展过程中发挥重要作用，不仅能够影响Caspase 激活进而抑制细胞凋亡，还参与细胞周期调控和肿瘤新生血管形成[8-9]。Bcl-2是第一个被发现的抑制细胞凋亡的基因，目前已发现其在胃癌、肺癌、口腔鳞状细胞癌、胰腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞异常高表达，是参与肿瘤细胞凋亡的重要基因[10-11]。

胃癌属于中医学“噎膈”、“积聚”、“胃脘痛”等范畴，其病因涉及六淫邪气、饮食不节等外因和脏腑失调、禀赋虚弱、七情所伤等内因，导致肝失疏泄，胃失和降，久病则脾胃损伤，瘀毒交结[11-12]。中医药在提高肿瘤患者治疗成功率、改善生存质量、延长生存期等方面效果显著，受到国内外研究者关注。研究发现，中医药可调节胃癌中 Survivin、Bcl-2等凋亡相关蛋白的表达。梁国英研究欣胃颗粒干预胃癌前病变的机制发现，模型组 Survivin 表达水平增高，而欣胃颗粒能抑制 Survivin 表达[13]。柚皮素可增加胃癌 SGC7901 细胞Bax、cleaved-Caspase-3表达，减少Bcl-2、 Survivin表达，从而起到促进胃癌细胞凋亡的作用[14]。

益气化瘀散结方是根据胃癌“正气亏虚为本，瘀毒互结为标”的病机而组方，方中党参补中益气，和胃生津；白术健脾益气，燥湿利水；黄芪益气补中；当归补血活血；川芎活血行气，祛风止痛；桃仁、红花活血化瘀；夏枯草消肿散结；虫破血散结；甘草调和诸药。诸药合用，共同发挥健脾益气、化瘀散结的功效。现代研究表明，方中党参、白术、黄芪、当归等均有抗肿瘤作用，且能提高机体免疫功能。本研究显示，与空白血清组比较，不同浓度益气化瘀散结方含药血清尤其是10%、20%浓度组均能不同程度抑制SGC-7901细胞的增殖。通过对细胞凋亡的观察发现，益气化瘀散结方含药血清尤其是10%、20%浓度组干预后，SGC-7901细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率均有不同程度的增加。通过Western-blot、Real-time PCR 对Survivin、Bcl-2基因的表达情况进行分析，结果显示，不同浓度益气化瘀散结方含药血清干预后，Survivin、Bcl-2蛋白及mRNA表达水平明显降低，这提示益气化瘀散结方抑制胃癌SGC-7901细胞增殖、促进胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用，可能与降低凋亡抑制蛋白Survivin、Bcl-2的表达相关。