CEACA M6与MMP-9在口腔鳞癌中的表达与临床意义

杨海燕 王 巍 赛音乌力吉 闫 冰 张连齐 李吉辰

口腔鳞癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，虽然放化疗和手术治疗已经大大提高了鳞癌患者的生存率，但是总体生存率也只能达到50%左右，并且发病率逐年上升[1～3]。随着对口腔鳞癌不断的深入研究，靶向治疗逐渐成为口腔鳞癌综合治疗的重要组成部分。癌胚抗原相关细胞黏附分子6（CEACAM6）为免疫球蛋白超家族的重要成员，是非特异性的交叉抗原[4]。CEACAM6 的相互交联还可通过升高c-Src 活性而增加肿瘤细胞黏附于细胞外基质[5]，在肿瘤转移和侵袭中发挥作用。CEACAM6在多种实体肿瘤，如肺癌、胰腺癌、胃肠肿瘤、乳腺肿瘤和卵巢癌等表达升高[6]。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）主要功能是可以突破细胞外基质及基膜，促进肿瘤向远处侵袭转移[7]。相关研究表明，CEACAM6 可通过MMP9 信号通路促进EMT 的发生，从而促进肿瘤的侵袭转移[8]；本实验通过研究CEACAM6 和MMP-9在口腔鳞癌中的表达的关系，为口腔鳞癌的治疗提供新的靶点。

资料和方法

1.材料：口腔鳞癌组织石蜡标本选取于哈尔滨医科大学第一临床医院病理科，选择2011年3月至2012年9月期间70 例患者为观察组，其中男性39例，女性31例；年龄在39～80 岁，平均年龄55 岁。分化程度：高分化51例，中低分化19 例。另取30例正常口腔黏膜组织石蜡标本作为对照组。据病例资料显示，所有患者术前均未行放、化疗等治疗，且70 例患者均采取口腔鳞癌病灶切除术加颈部淋巴结清扫术。根据国际抗癌联盟（UICC）2010年制订的TNM 分期标准对口腔鳞癌进行临床分期[9]，其中Ⅰ～Ⅱ期42 例，Ⅲ～Ⅳ期28 例。

2.主要试剂：CEACAM6 兔抗人多克隆抗体（北京博奥森生物工程有限公司）、MMP-9 兔抗人多克隆抗体（北京博奥森生物工程有限公司）、免疫组化试剂盒（武汉博士德生物有限公司）、DAB 显色试剂盒（武汉博士德生物有限公司）。

3.免疫组织化学检测：将组织石蜡切片置于67℃烤箱中烤90min，脱蜡，PBS 冲洗3min×3 次。3% H2O2室温下孵育10min，PBS 冲洗3min×3 次。PBS 浸泡5min。将切片浸泡于EDTA 缓冲液，高压蒸汽锅行抗原修复，待压力锅喷气时，计时3min 后室温下自然冷却。PBS 冲洗5min×3 次。滴加CEACAM6（1:100）及MMP-9 多克隆抗体（1:100），4℃恒温环境下过夜，蒸馏水冲洗5min 后PBS 冲洗3min×3 次；滴加二抗工作液，37℃孵育30min;蒸馏水冲洗3min 后PBS 冲洗3min×3 次；DAB 试剂盒显色，蒸馏水冲洗终止显色反应。苏木精复染，蒸馏水充分冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。

4.结果判断：CEACAM6 和MMP-9在口腔鳞癌组织中的抗原阳性表达均为细胞质被染出棕黄色颗粒，亦少见细胞膜表达。每张切片随机观察5 个高倍镜不重叠视野（×400），每个视野计数200 个细胞。用双盲法，以阳性细胞率及染色强度行半定量评分，阳性细胞率以≤10%、＞10%～50%、＞50%～80%、＞80%分别记为0、1、2、3 分；按染色程度评分：无染色为0 分、浅黄色为1 分、棕黄色为2 分、棕褐色为3 分；按两者的得分之积来判定结果：＜3 分计为阴性（-），≥3 分计为阳性（+）。

5.统计学处理：本实验采用SPSS 20.0 统计软件，计数资料采用χ2检验，Spearman 法行等级相关分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.CEACAM6和MMP-9在口腔鳞癌及正常口腔黏膜组织中的表达比较：CEACAM6 和MMP-9在口腔鳞癌中的表达均主要位于胞质中，癌细胞亦都被染成棕褐色，少见细胞膜表达。而两者在正常口腔黏膜组织中低表达或不表达（图1）。CEACAM6在口腔鳞癌组织中阳性表达率分别为71.43%（50/70），MMP-9 则为74.29%（52/70），在正常口腔黏膜组织中阳性表达率分别为16.67%（5/30）、13.33%（4/30）。两者在观察组中的阳性表达率均明显高于正常口腔黏膜组织（P＜0.05），见表1。

表1 CEACAM6和MMP-9在口腔鳞癌及正常口腔黏膜组织中的表达

2.口腔鳞癌组织中CEACAM6 及MMP-9 的表达与患者临床病理参数的关系

3.口腔鳞癌组织中CEACAM6 和MMP-9 表达的相关性：70 口腔鳞癌组织中CEACAM6 阳性表达的有50 例（MMP-9 阳性44 例，阴性6 例），CEACAM6 阴性表达的有20 例，（MMP-9 阳性6例，阴性12 例）。经Spearman 等级相关性分析，两者间的表达呈明显正相关（r＝4.712，P＜0.05），见表3。

表2 CEACAM6、MMP-9 的表达与口腔鳞癌临床病理参数的关系

表3 CEACAM6和MMP-9在口腔鳞癌组织中表达的相关性

讨 论

CEACAM6 为免疫球蛋白超家族的重要成员，是非特异性的交叉抗原，通过糖基磷脂酰肌醇连接在细胞膜上[10]。CEACAM6 属于信号传导通路的下游基因，它的表达产物位于细胞浆内，通过转录和中介调节因子共同促进肿瘤发生。它的表达在肿瘤前期病变中升高，可能作为肿瘤癌变的重要标志物[11]。研究表明，CEACAM6在正常组织中不表达或低表达，在恶性上皮细胞肿瘤（如胃肠道肿瘤、胰腺癌、肺癌、乳腺癌）中普遍表达增高[12～13]，但目前CEACAM6在口腔鳞癌中的表达尚未有相关报道。Katayama[14]等报道的研究结果表明：MMP-9 的表达水平反应了口腔鳞癌的转移能力，它的过度表达使细胞外基质和基底膜被降解和破坏，肿瘤细胞得以向淋巴管内浸润，造成肿瘤的转移。因此，MMP-9 的表达与肿瘤的侵袭和转移有关，可作为判断口腔鳞癌侵袭和转移潜能的生物学标志之一。

本实验研究中，观察组中CEACAM6 的阳性率为71.43%，对照组为16.67%，CEACAM6在口腔鳞癌中的表达远高于在正常组织中的表达。同时发现CEACAM6 的高表达与年龄（P＝0.513）、性别（P＝0.236）及肿瘤大小（P＝0.235）无关，而与口腔鳞癌的组织分化程度（P＝0.006）及TNM 分期（P＜0.001）有关，且CEACAM6 表达越高，恶性肿瘤分化程度越高，推测CEACAM6 可能作为评估口腔鳞癌的分化程度的一个重要指标，并且有望在临床上成为口腔鳞癌的标志物。目前的研究表明[15]，在肿瘤组织中，CEACAM6 主要通过打破组织结构，影响细胞极性及分化，抗肿瘤细胞失巢凋亡，增加肿瘤侵袭、转移能力，从而促进肿瘤的发生、发展。

本实验中，口腔鳞癌组织中MMP-9 的阳性表达率为74.29%，正常组织阳性表达率为13.33%，表明MMP-9在口腔鳞癌中高表达，并且MMP-9 的表达与年龄（P＝0.253）、性别（P＝0.082）及肿瘤大小（P＝0.066）无关，与口腔鳞癌的组织分化程度（P＝0.01）及TNM 分期（P＝0.003）有关。在正常组织中MMP-9 通过酶解作用，维持细胞外基质中胶原合成与分解之间的平衡。在肿瘤组织中MMP-9 的过量表达不但可以降解基底膜和细胞外基质中的Ⅳ型胶原，还可以促进肿瘤周围微血管的生长。口腔鳞癌细胞中基质降解酶的产生可直接影响肿瘤的转移能力;肿瘤细胞分泌MMP-9 的差异反映了肿瘤个体侵袭转移能力的不同。因此，MMP-9 不仅可作为口腔鳞癌的肿瘤标志物，而且还可作为评估口腔鳞癌浸润、转移的重要指标。

CEACAM6 可通过MMP9 信号通路促进EMT的发生，从而促进肿瘤的侵袭转移；也可以通过c-src 途径避免肿瘤失巢凋亡，同时有效降低肿瘤细胞中E-cadherin 的表达，使肿瘤的侵袭能力明显增强[16]。Chen 等[17]在胰腺癌的研究中发现，CEACAM6能够通过介导EMT 促进胰腺癌的发生、发展，在进一步的动物实验中也验证了这一点[18]。同样，在胃癌的研究中也得出了相似的结论[19]：CEACAM6 增加了金属基质蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）的活性，而金属基质蛋白酶被认为有促进EMT 形成的作用；同时，研究还发现CEACAM6 可增加AKT 磷酸化的水平并能被PI3K 的阻断剂逆转产生间质向上皮转化（mesenchymal-epithelial transition，MET） 改变。以上这些研究表明CEACAM6 可能通过MMP-9、PI3K/AKT 信号通路促进了EMT 的发生，从而增强了肿瘤侵袭和转移。本实验研究结果显示：CEACAM6 和MMP-9在口腔鳞癌中的表达呈正相关（r＝4.712，P＝0.0001），实验结果与现已有研究结果一致，CEACAM6与MMP-9密切相关，并相互作用，促进肿瘤细胞的转移侵袭。

综上所述，本研究结果表明CEACAM6 和MMP-9与口腔鳞癌的发生、发展及远处转移密切相关，二者可作为口腔鳞癌的早期诊断的重要指标，评估肿瘤的转移能力及预后，为口腔鳞癌的治疗提供新的思路和途径。