广州市单项核酸检测阳性无偿献血者追踪结果分析*

李仲平， 林诗雅， 郑优荣， 梁浩坚， 王淏， 黄志健， 谢君谋， 陈锦艳， 李丰沛

广州血液中心广州市医学重点实验室(血液安全重点实验室) (广东广州 510095)

为进一步保障临床用血安全，采供血机构引进核酸扩增检测技术(nucleicacid amplification test，NAT)对献血者血液进行HBV、HCV、HIV筛查，血液常规筛查血清学检测的是抗原或抗体，NAT技术直接检测病毒的核酸，弥补了病毒血清学检测的不足，提高了检测敏感度，大大缩短了相关病毒检测“窗口期”，是血清学检测的有力补充[1-2]。然而，在实际筛查中采供血机构常检测出一部分献血者样本血清学血液筛查合格而NAT检测(3种病毒联检)呈阳性反应，称单项NAT阳性样本，发现单项NAT阳性样本后进行NAT 鉴别试验，以鉴定出样本含有何种病毒。按照现行的血液筛查策略，凡血清学筛查阴性而NAT联检为阳性的样本即判为不合格，暂时屏蔽献血者(3～6个月后可召回复查)。在实际检测工作中存在相当一部分单项NAT阳性而鉴别试验呈阴性的样本，称之为NAT非重复反应性样本，其检测结果存在一定不确定性，献血者血液的安全性及献血资格更有待进一步确定。目前有关规范尚未要求采供血机构将NAT鉴别试验结果纳入业务系统，工作人员也无法告知献血者准确的检测结果。为解答以上疑问，本研究对检出的单项NAT阳性献血者的检测结果进行统计分析，并追踪回访，结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年1月至2018年6月，广州血液中心采集的无偿献血标本1 166 333份。所有无偿献血者均符合现行的卫生部《献血者健康检查要求》(GB18467-2001)，血液采集后同时留取1支核酸检测标本和1支酶免检测样本。NAT标本采集、保存和处理等严格按照卫生部NAT技术要求操作。采用无菌带分离胶抗凝(K2-EDTA) NAT专用真空试管，留取5～6 mL全血标本供NAT检测。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 酶联免疫法检测设备 包括自动酶联免疫检测分析仪 (瑞士HAMILTON，FAME24/30)，自动酶联免疫检测加样仪加样仪(瑞士 HAMILTON，ML-STAR 8CH)，340rt酶标仪(奥地利Anthos)，日立7180全自动生化分析仪。主要筛查试剂：HBsAg采用北京万泰和上海科华；抗-HCV采用珠海丽珠和上海科华；抗-HIV采用美国伯乐和北京万泰；抗-TP采用北京万泰和上海科华；ALT采用北京万泰和上海科华，筛查试剂均经国家批检合格并在有效期内使用。

1.2.2 核酸检测设备与试剂 盖立福 Procleix TIGRIS和罗氏Roche s201系统，及配套核酸检测试剂：诺华(Grifols) Proleix Ultrio及Ultrio Plus Assay核酸联检试剂盒及其核酸鉴别试剂盒，罗氏MPX 2.0试剂。

1.3 检测方法与判定标准 献血者血液样本进行ELISA(以下称EIA)和核酸检测。酶免检测采用2种不同厂家试剂检测献血者血液标本的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP 及ALT。任一检测项目2种试剂反应性判为不合格; 1种试剂反应性者则用2种试剂对原管进行双试剂双孔检测，至少1孔反应性者判为不合格。NAT有反应性判为HBV、HCV、HIV NAT联检反应性; 单项NAT阳性样本进行HBV、HCV、HIV NAT鉴别实验，分别使用3种病毒的特异性探针试剂以检测样本中是否存在相应病毒，任一项目有反应性判为鉴别反应性，NAT鉴别试验结果仅作为科研数据保存，尚未纳入常规献血者业务系统。

1.4 献血者追踪回访 单项NAT阳性的单采血小板献血者在献血后3～6个月后进行追踪回访，召回献血者重新抽取血液样本，复核全部血液筛查项目，检测合格则解除献血者的锁定状态，献血者可以重新参加无偿献血；如检测结果出现双试剂阳性项目或重复原来单试剂阳性项，则屏蔽该献血者。

1.5 统计学方法 使用SPSS 19.0统计软件，阳性率差异比较用2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各年单项NAT阳性率情况 无偿献血者血液标本1 166 333份，共检测出单项NAT阳性样本2 633例，阳性率为0.23%，863例鉴别阳性，鉴别阳性率为32.78%。各年单项NAT阳性率比较有差异，2=153.873,P<0.05；NAT鉴别阳性率有差异，2=21.894,P<0.05。见表1。

表1 单项NAT阳性样本检出情况

2.2 单项NAT阳性献血者复检结果 我们对2 633单项阳性献血者进行电话回访并召回，邀请献血者在献血后3～6个月后回血液中心重新抽取血液样本复查全部筛查项目。2015年1月至2018年6月共有665例单项NAT阳性献血者回到血液中心进行复查，515例献血者复查合格，解除献血锁定状态，150例献血者复查结果仍旧出现酶免检测项目阳性或者仍为单项NAT阳性，本中心按照《献血者归队指南》(第2版)中的要求，将其献血资格永久屏蔽。见表2。

表2 单项NAT阳性献血者复查结果 例

注：各年解锁率之间差异没有统计学应意义(2=1.57,P>0.05)

2.3 解锁献血者后续献血次数结果 515例解锁的献血者在复检合格恢复无偿献血资格后，共有156例献血者再次参加无偿献血1次，108例献血者献血2～3次，74例献血者在解锁后有多于3次的献血记录，以上献血者(占65.63%)血液筛查结果均为合格，其余177例献血者(占34.37%)至成稿没有再次参加无偿献血。

2.4 单项NAT阳性献血者核酸鉴别试验结果 在召回复检的665例单项NAT阳性献血者中，回顾性分析338例献血者的鉴别试验结果，其中71例HBV DNA鉴别试验阳性(占21.01%)，没有鉴定出HCV及HIV病毒核酸阳性样本。见表3。

表3 338名单项NAT阳性献血者核酸鉴别试验结果 例(%)

2.5 NAT疑难结果献血者后续献血记录追踪 对35例在上一次献血血液筛查中呈单项NAT阳性、HBV DNA NAT鉴别试验同为阳性，而在召回复查中全项合格的献血者(首次NAT+，鉴别+，复检-)进行了后续献血追踪。12例献血者至成稿没有再次参加无偿献血，其余的23例献血者随后再次参加无偿献血，情况如下： 12例献血者有1次或1次以上的献血记录，所有血液筛查结果均为合格； 7例献血者在解锁后的首次无偿献血血液筛查中再次出现单项NAT阳性的结果；其余4例献血者解锁后参加无偿献血，有1次或者1次以上的合格献血记录，但最后又再次出现单项NAT阳性。本中心暂时屏蔽对以上再次出现单项NAT阳性的献血者，其血液产品作报废处理。

3 讨论

预防与控制输血相关传染病是输血领域最关注的热点之一。将NAT技术应用于血液筛查，可以显著降低因血清学漏检而导致的输血传播疾病的残余风险，进一步提高血液安全[1,3]。国家卫计委于2015年颁布实施《血站技术操作规程》，将NAT纳入常规血液筛查中，在全国采供血机构实行输血相关病毒核酸检测的全覆盖[4]，我国许多城市自引入NAT后也多有相关报道[5]。

自2010年10月起广州血液中心采用“2 遍ELISA+1遍NAT” 的筛查模式对献血者血液进行筛查，对广州地区全部无偿献血者血液标本进行HBV、HCV和HIV的NAT检测。2015年1月至2018年6月共检出2 633份酶免检测阴性的单项NAT阳性样本，阳性率为0.23%，高于赵红娜等[6]报道郑州地区的检测结果0.06%，略低于王立林等[7]所报道的重庆市的阳性率0.28%。我们对665例单项NAT阳性献血者复查结果的追踪分析，40例在复检中血清学酶免检测项目出现了阳性结果，其中21例HBsAg阳性，3例出现抗-HIV阳性(后确证为HIV感染)，可见这24例献血者很可能由于处于酶免检测“窗口期”以致的漏检。血液常规筛查血清学检测的是抗原或抗体，NAT检测的是病毒核酸，NAT能从血清学检测阴性的标本中检出漏检的病毒感染者，是血清学检测的有力补充。

2015年1月至2018年6月本中心单项32.78%的NAT阳性献血者在鉴别试验中呈反应性，与重庆市的结果32.77%[7]接近，而略高于青岛市的结果(27.5%)[8]。目前核酸检测系统鉴别试验的成功率偏低是目前国内采供血机构所面临的共同问题[9]。这类样本NAT结果的非重复性给采供血机构造成了一定的困扰。笔者推断血液NAT非重复性结果可能来自于以下两方面。

第一、样本首次NAT联检时出现假反应性结果。在缺乏有关血清学补充试验(如：抗-HBc)和病毒定量分析结果的条件下，我们通过对献血者进行追踪回访，重复全项血液筛查项目，对献血者血液的安全性进行评估。本研究发现，回顾性分析部分召回复检的单项NAT阳性献血者鉴别试验结果，338例献血者中有267例(占79.00%)的上一次献血筛查中单项NAT阳性，但鉴别试验呈阴性反应。他们当中有244例献血者复检合格，23例复检NAT不合格。这244例献血者共经历3次NAT检测，具体为NAT联检(+)、NAT鉴别(-)、复检NAT联检(-)。我们推断他们在初次NAT联检中出现了假反应性结果。此外，有338例献血者在解除献血资格锁定后继续参加无偿献血1次或多次，检测结果均为合格，推断他们的单项NAT不合格为假阳性结果。本中心按照《献血者屏蔽与归队指南》(第2版)要求，根据复检结果恢复了一部分本来屏蔽的献血者的献血资格。与此同时，我们也留意到177名献血者在召回复检合格后再无献血的记录，推断假阳性筛查结果对献血者的献血热情造成一定不良影响，NAT假阳性筛查结果所造成的血液资源浪费和献血者队伍流失应引起采供血机构的注意。

第二、样本中存在低浓度病毒核酸也可能造成鉴别试验假阴性结果。有国内学者报道，NAT非重复反应性样本中也可能是由于样本中的病毒浓度低，而造成鉴别试验的假阴性结果，这些样本中的18.5%可以被定量系统检测出HBV DNA，提示样本中存在低浓度的HBV[8]。如病毒浓度处于极低的水平，由于病毒颗粒在血浆中的泊松分布，以至检测取样时未能吸取到带有病毒的样本[10]；也可能由于储存和运送条件不符合相关要求，或是干扰物质的存在，导致样本中病毒降解造成鉴别试验假阴性结果。本次研究数据显示：59例单项NAT阳性献血者复检仍为NAT阳性，当中的23例虽然HBV DNA NAT鉴别试验为阴性，但在2次NAT 2次联检中均出现了阳性反应，故不能排除是由于病毒浓度低所造成的鉴别试验漏检，我们将在补充有关试验数据后另文报道。中国是乙型肝炎(乙肝)流行率较高的国家，HBV输血残余风险主要来自于血清转换前窗口期、变异病毒株和隐匿性HBV感染(OBI)三方面[11-12]。在开展核酸检测以来，采供血机构实验室筛查出的单项NAT阳性样本中，鉴别试验阳性的绝大多数都是HBV DNA阳性，提示OBI可能是导致NAT 联检阳性而鉴别检测阴性结果的主要原因。OBI献血者标本中病毒浓度极低，易造成漏检和重复检测结果不一致的现象[13]。35例献血者在血液筛查中NAT阳性，鉴别试验HBV DNA阳性，在献血后3个月后他们的复查结果合格，按照《献血者屏蔽与归队指南》(第2版)建议，本中心解除了对他们的屏蔽状态。我对23例有献血记录的献血者跟踪汇总，当中12例献血者在后续的献血血液筛查中均合格，11例献血者在解锁屏蔽后再次献血又再次出现单项NAT阳性的结果。已有报道，对于反复出现的NAT非重复反应性样本，采用其他NAT方法，或乙肝感染标志物(如乙肝核心抗体)进行检测时，部分样本仍然呈现阳性结果，提示这些样本中存在一定比例的真阳性[8]。《献血者屏蔽与归队指南》(第2版)中建议采供血机构永久屏蔽复查仍是单项NAT阳性(即连续2次NAT阳性)的献血者，尚未覆盖多次NAT结果不一致(间隔出现阴性与阳性)的非重复反应性样本，特别是NAT联检(+)、NAT鉴别(+)、复检NAT联检(-)的样本，单凭重复全项检测有可能无法排除具有潜在传染风险的血液，如：低浓度感染因子或病毒变异，而且如何区分假阳性样本和病毒低浓度水平样本，采供血机构缺乏更有效可靠的检测策略，献血者血液安全性的判断标准也有待改进，在缺乏血清学补充试验结果和病毒定量结果以前解锁NAT疑难结果献血者，其献出的血液可能对血液安全造成危害。

笔者认为，采供血机构应坚持以血液安全为首要立足点，制定献血者屏蔽与归队策略，然而高敏感度NAT试剂的应用无可避免会造成一部分血液资源由于筛查假阳性问题而浪费，建议采供血机构将NAT鉴别试验结果纳入常规业务系统，对于单项NAT阳性样本增加NAT检测次数或使用敏感度相当的另外一种NAT检测试剂进行复查，相应献血者复查时补充HBV相应血清学试验(如抗-HBc)及HBV DNA定量结果[14-16]，将有助于对献血者血液的安全性作更准确的评估，对单项NAT阳性献血者屏蔽或归队作更准确判断。总之，如何完善单项NAT阳性献血者屏蔽与归队检测策略；爱护献血者爱心，做好检测结果告知与解释将是采供血机构今后的工作重点。