液相色谱-质谱联用测定果葡糖浆中葡萄糖、果糖含量

毛燕琴，刘敬，陈积红，3，胡伟，王曙阳，李文建，3

(1.中国科学院近代物理研究所，甘肃 兰州 730000；2.中国科学院大学生命科学学院，北京 100049；3.甘肃省辐照诱变育种工程实验室，甘肃 武威 733001)

果葡糖浆亦称高果糖浆(high fructose syrup)或异构糖浆，是以酶法糖化淀粉所得的糖化液经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖组成的一种混合糖浆[1-2].果葡糖浆甜度与蔗糖相近，且具有冷甜性、渗透压大、易于吸收、抗结晶性强、溶解度高、抗龋齿性、保湿性好等优良特性，被广泛应用到医疗保健行业与食品工业中[3-6].在果葡糖浆生产过程中，葡萄糖、果糖含量的变化是生产过程的重要参数指标，因此快速准确测定其含量变化具有重要的实际意义.

目前，糖类物质的检测方法有滴定法、容量法、色谱分析法[7-8]、比色法[9]、旋光法[10].如翟建云等利用分光光度法测定毛竹快速生长期茎秆不同节间果糖、葡萄糖的变化[11]，姚令文等用超高效液相色谱-蒸发光检测器法测定生脉注射液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量[12].根据我国检测食品单糖和二糖的国标GB 5009.8-2016[13]规定，果糖、葡萄糖、蔗糖的检出限为0.2%.高效液相色谱法很容易达到这样的检测指标，但在实验研究中，经常需要实时检测衡量的单糖、二糖含量.这时就需要更灵敏的检测器.

质谱检测器相对于其他检测器具有更高的灵敏度，且对样品纯度的要求更低，减少了工作量和分析时间[14].液相色谱-质谱联用技术结合质谱鉴别力强的特点和液相色谱分离度高的优势，具有高通量、灵敏度高、准确性强、操作简单等特点，是配备质谱的实验室可选用的最佳检测技术[15].现在已有利用超高压液相色谱-质谱连用检测葡萄糖、果糖及低聚糖的报道[16-17].但是鉴于单糖极性弱的缺点，在具体检测过程中需要在流动相中加入甲酸铵以提高检测精确度，现有文献对甲酸铵浓度对液质联用检测果糖、葡萄糖的影响尚无具体报道.本研究拟建立超高压液相色谱-质谱联用测定果葡糖浆中葡萄糖、果糖含量的实验方法.通过优化质谱条件(碰撞能量)，优化目标物的检出限；通过优化色谱条件(梯度洗脱程序、流动相的比例、甲酸铵浓度)，实现葡萄糖、果糖在色谱柱中的良好分离；以期建立一种准确、灵敏、快速的检测方法，为果葡糖浆生产过程中的质量控制提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜高粱果葡糖浆(甘肃省辐照诱变育种工程实验室提供)、葡萄糖、果糖标准品(纯物质)、甲酸铵(纯度≥99.0%)购自美国Sigma公司、乙腈(色谱纯)购自美国Fisher公司；水(高纯水)，购自屈臣氏.

1.2 仪器与设备

进样瓶(2 mL)，甘肃海智色谱技术有限公司；聚偏二氟乙烯针头过滤器(13 mm，0.22 μm)，甘肃海智色谱技术有限公司；BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色谱柱，美国Waters公司；TE101-L天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；Qube超高压液相色谱-串联四极杆质谱工作站，BRUKER.

1.3 试验方法

1.3.1 质谱条件的选择 分别用75%乙腈配制浓度分别为3.9、13 μg/mL葡萄糖、果糖的单标溶液，采用直接进样方式分别注入HESI离子源中，进样量为1 μL，流速为200 μL/min，喷雾电压(+)为4 000 V，喷雾电压(-)为3 500 V，加热探针温度为400 ℃，锥体温度为350 ℃，在负离子检测方式下进行母离子全扫描，得到葡萄糖、果糖的分子离子，再以每种糖的准分子离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，采集全扫描的二级质谱图，根据碎片离子信息，选择2种糖的最佳质谱参数.

1.3.2 色谱条件的选择 色谱柱：BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱温：室温；进样量：1 μL；柱压：75 bar；流速：200 μL/min；流动相：A相为甲酸铵水溶液，B相为乙腈.梯度洗脱程序见表1.

表1 梯度洗脱程序

1.3.2.1 流动相比例对检测结果的影响 以A相20 mmol/L甲酸铵水溶液，B相乙腈为流动相，乙腈与水的比例分别为75∶25，85∶15，观察所得到的色谱图，选择最适的流动相比例.样品采用葡萄糖浓度为0.756 8 μg/mL、果糖浓度为0.801 9 μg/mL的混合标准溶液，进样量为1 μL，流速为200 μL/min.

1.3.2.2 甲酸铵浓度对检测结果的影响 A相的甲酸铵浓度分别设计为5 mmol/L，20 mmol/L，40 mmol/L，检测不同甲酸铵浓度对葡萄糖和果糖色谱结果的影响.样品采用葡萄糖浓度为0.756 8 μg/mL、果糖浓度为0.801 9 μg/mL的混合标准溶液，流动相乙腈与水的比例为75∶25(V/V)，进样量为1 μL，流速为200 μL/min.

1.3.3 标准溶液的配制

1.3.3.1 标准贮备液的配制 分别准确称取390、1 300 μg葡萄糖、果糖标准品，用75%乙腈溶液定容至1 mL，即390 μg/mL葡萄糖标准贮备液、1 300 μg/mL果糖标准贮备液.

1.3.3.2 标准工作液的配制 用1.3.3.1配制的标准贮备液分别依次配制葡萄糖质量浓度分别为1.56、3.12、3.9、7.8、31.2 μg/mL、果糖质量浓度分别为6.5、13、16.25、32.5、130 μg/mL的各系列标准混合溶液.

1.3.4 样品处理 向甜高粱果葡糖浆样品中添加3%活性炭，80 ℃搅拌中水浴0.5 h后，在转速4 000 r/min条件下离心5 min，取上清液后在硅藻土助滤取上清液.吸取100 μL上清液于装有900 μL 75%乙腈溶液的离心管中，涡旋混合均匀后即成10-1稀释液，再按上述步骤依次稀释到10-2、10-3稀释液，涡旋混合均匀后用0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液作为供试样品溶液，备用.

2 结果与分析

2.1 质谱条件的选择

糖分分析用负离子模式质谱响应可达105级，而正离子模式响应差[14]，因此本实验采用负离子扫描方式.采用直接进样方式分别将葡萄糖、果糖单标溶液注入HESI离子源中，在负离子检测方式下进行母离子全扫描，得到葡萄糖、果糖的分子离子分别为179.1、179.1.分别以葡萄糖179.1、果糖179.1分子离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，得到碎片离子信息，然后再对二级质谱参数如碰撞能量等进行优化，使每种糖的定性离子与定量离子产生的离子对强度比例达到最大时为最佳，从而得到每种糖的最佳质谱参数(表2).

表2 葡萄糖、果糖的质谱分析条件参数

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 流动相比例对检测结果的影响 按照不同流动相比例检测样品得到的色谱图如图1～2.从图1～2可以看出，流动相乙腈与水的比例为75∶25条件下，在各峰的分离度较好的前提下保留时间也较短，所以选择流动相乙腈与水的比例为75∶25进行样品的检测.因为出峰时间较短，所以本试验的洗脱程序为先通过等度洗脱分离出果糖和葡萄糖，再进行梯度洗脱清除残留样品，最后恢复到进下一个样品的AB相比例.葡萄糖和果糖为同分异构体，不易分离，流动相中乙腈比例及其变化对化合物的保留有较大的影响，进而影响分离度及分离选择性[18-19]，适当增加流动相中乙腈含量有助于葡萄糖、果糖的分离[16]，本试验结果与已有报道符合.

图1 样品色谱图(乙腈∶水=85∶15)Figure 1 The chromatogram of sample(acetonitrile∶water=85∶15)

图2 样品色谱图(乙腈∶水=75∶25)Figure 2 The chromatogram of sample (acetonitrile∶water = 75∶25)

2.2.2 甲酸铵浓度对检测结果的影响 本试验尝试在流动相A相中加入甲酸铵，并研究不同浓度的甲酸铵对检测结果的影响，添加不同浓度甲酸铵检测样品得到的色谱图见图3～5.从图3～5可以看出，甲酸铵浓度对检测结果有显著影响，浓度过大或过小，都不能得到较好的峰形.A相用20 mmol/L的甲酸铵水溶液既能保证流动相基质不干扰测定结果，也有效增强待测物质的检出信号，达到了预期效果.流动相条件的选择主要考虑被分析物的分离、检测的灵敏度和色谱峰形.有文献报道流动相中加入缓冲盐可以降低固定相与带电荷溶质之间的静电作用，调节峰形及物质的保留，不加缓冲盐时易造成峰拖尾现象的出现[18].也有文献报道[20]甲酸作为一种改性剂在一定程度上可以增强质谱响应，而且可以有效地改善色谱峰拖尾的现象.试验结果与已有报道符合.

图3 样品色谱图(甲酸铵浓度：5 mmol/L)Figure 3 The chromatogram of sample (the concentration of ammonium formate：5mmol/L)

图4 样品色谱图(甲酸铵浓度：20 mmol/L)Figure 4 The chromatogram of sample (the concentration of ammonium formate:20 mmol/L)

图5 样品色谱图(甲酸铵浓度：40 mmol/L)Figure 5 The chromatogram of sample (the concentration of ammonium formate:40 mmol/L)

2.2.3 工作曲线与检出限 将1.3.3.2配制的各系列标准混合溶液在进样量为1 μL，柱压为75 bar，流速为200 μL/min，流动相：A相为20 mmol/L甲酸铵水溶液，B相为乙腈，且乙腈与水的比例为75∶25的条件下进行液质联用上机分析，以化合物的峰面积为纵坐标(Y)、对应的质量浓度为横坐标(X，μg/mL)绘制标准曲线，按3倍RSN计算检出限.结果表明，本方法在一定的浓度范围内线性关系良好，相关系数(R2)均大于0.99(表3)，检出限明显低于高效液相色谱法.

2.2.4 样品检测 将不同酶解条件的甜高粱果葡糖浆按上述1.3.4方法进行前处理，在进样量为1 μL，柱压为75 bar，流速为200 μL/min，流动相：A相为20 mmol/L甲酸铵水溶液，B相为乙腈，且乙腈与水的比例为75∶25的条件下进行液质联用上机分析.另外用分光光度法检测所有样品中葡萄糖、果糖含量.经配对t检验，P≥0.05，2种方法检测结果无显著性差别，结果见表4.

表3 葡萄糖、果糖的标准曲线方程、相关系数、线性范围和检出限

表4 样品中葡萄糖和果糖含量检测结果

3 讨论

流动相条件的选择主要考虑被分析物的分离、色谱峰形和检测的灵敏度。葡萄糖和果糖为同分异构体，液相色谱不易分离。在液相色谱模式中通常以高比例有机溶剂(常为乙腈)为流动相[18]，通过逐渐增大水的比例调节流动相的极性，依次洗脱出极性不同的溶质。该色谱模式中，化合物的保留随其极性的增大而增强，流动相中有机相的含量是控制分离的主要因素。并发现，流动相中乙腈比例及其变化对化合物保留的影响较大，进而影响分离选择性及分离度[19]，适当增加流动相中乙腈含量有助于果糖、葡萄糖的分离[16]。通过试验发现，采用水-乙腈(25∶75，V/V)时，可以较好地分离样品中果糖、葡萄糖，且保留时间也较短。单糖极性较弱，需要在流动相A相中加入一些易挥发盐的缓冲液来提高检测精确度，如甲酸铵、乙酸铵，也可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等。通过实验发现，流动相A相用20 mmol/L的甲酸铵水溶液，在保证流动相基质不影响检测结果的前提下，增强了待测物质的检出信号。

果葡糖浆中果糖、葡萄糖含量较高，用75%乙腈多倍稀释后可有效减小基质效应，因此样品需采用75%乙腈依次稀释1 000倍后用0.22 μm微孔滤膜过滤后才可进样分析。

采用高效液相色谱法对糖类分析，检测器可以采用示差检测器，蒸发光检测器，紫外检测器。紫外检测法测定响应值低，准确度差；示差折光检测法受温度等外界条件影响较大，方法稳定性差、基线噪声大[21]。本文建立的液相色谱-质谱联用检测法，作为一种通用型检测器，对温度变化不敏感，基线稳定，灵敏度高。

4 结论

本试验建立了液相色谱-质谱联用法测定果葡糖浆中葡萄糖、果糖含量的测定方法。利用性能可靠的BEH Amide色谱柱，参照本方法，在10 min内即可完成果葡糖浆中的糖成分的定量分析，相较于其他检测方法，缩短了分析时间，并且检出限低(葡萄糖0.32 μg/mL，果糖0.74 μg/mL)，灵敏度高，是测定葡萄糖和果糖含量的一个精确方法。新建立的方法操作简便、分析速度快、灵敏度高，更适用于分析果葡糖浆中的糖的组分。