LncRNA FOXD2-AS1对胶质瘤细胞增殖及迁移能力的影响

上官文兵，李朝晖，张佳琦，韦 博*

(1.浙江中医药大学 生命科学学院，杭州 浙江310052；2.吉林大学中日联谊医院 神经外科，吉林 长春130033)

长链非编码RNA(lncRNA)是一类非编码蛋白质的RNA，长度大于200个核苷酸，通过对其下游靶基因的调控参与肿瘤细胞发生发展的多个过程[1,2]。最新研究已经发现，lncRNA FOXD2-AS1在黑色素瘤、肝癌、胃癌中高表达且促进肿瘤增殖及侵袭[3,4]。本研究利用siRNA 技术沉默lncRNA FOXD2-AS1基因，通过MTT法、平板克隆形成实验和transwell小室等方法检测沉默FOXD2-AS1后对胶质瘤细胞增殖及迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

8.0 μm的transwell小室购自美国Millipore公司，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，MTT粉购自江苏凯基生物技术股份有限公司，Giemsa染液购于上海源叶生物科技有限公司，DMSO 购于 Sigma-VETEC，si-FOXD2-AS1由百奥生物技术有限公司合成，siRNA序列：上游为5′-GCGAAGAGUACGUUGCUAUTT-3′; 下游为5′-AUAGCAACG UACUCUUCGCTT-3′。

1.2 细胞培养

人脑胶质瘤细胞系U251、A172均购自ATCC(American Type Culture Collection)，DMEM 高糖培养基、含 EDTA 0.25% 胰酶购自 GIBCO 公司，新生牛血清购自美国 Hyclone 公司。当细胞汇合度达 80%以上时，弃去原培养基，加入1 mL胰酶消化细胞 2 min后加入1 mL DMEM 高糖培养基终止消化，吹打混匀，800 rpm离心5 min。离心结束后加入一定量的DMEM高糖培养基重悬细胞并调整细胞密度重新接种于六孔板，置于培养箱中继续培养。

1.3 MTT assay

取转染4 h后的胶质瘤细胞，消化离心结束后用DMEM高糖培养基重悬细胞，96孔板中每孔接种5000个细胞，培养0 h、24 h、48 h、72 h和96 h后每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT，培养4 h后弃去原培养液，每孔加入 150 μl DMSO溶液，剧烈震荡15 min溶解甲瓒，细胞能量代谢仪于490 nm处测定OD值。

1.4 平板克隆形成实验

取转染48 h后的胶质瘤细胞，消化离心收集细胞，然后用DMEM高糖培养基重悬细胞，以每孔200个细胞的密度接种于12孔板内，置于培养箱内培养。7-14 d后，弃去原培养液后每孔加入1 mL PBS 清洗3次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛避光固定30 min，每孔加入1 mL Giemsa染液染色15 min。染色结束后PBS 清洗3次，观察拍照并计数不同组的细胞克隆数。

1.5 Transwell小室

胶质瘤细胞消化离心结束后用DMEM高糖培养基重悬细胞。以每孔1×105个细胞的密度接种于transwell上室内。下室加入800 μL含20%FBS的DMEM培养液，培养36 h后，加入1 mL 4%多聚甲醛避光固定30 min，用Giemsa染料染色60 min，擦去滤膜上层细胞，于正置显微镜下观察拍照并计数穿过上室的相对细胞数。

1.6 脂质体转染法

分别用无血清无双抗培养基稀释脂质体和siRNA，轻轻混匀并室温孵育后将混合物加入六孔板中，轻轻混匀后于培养箱中培养4-6 h后，将培养基换为含10%胎牛血清的DMEM培养液。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 LncRNA FOXD2-AS1促进胶质瘤细胞的增殖能力

为研究lncRNA FOXD2-AS1对胶质瘤细胞增殖能力的影响，利用脂质体瞬转si-FOXD2-AS1，MTT法检测不同时间点胶质瘤细胞的增殖率时发现在96 h U251的增殖率为19.8%±1.09%，U251 si-FOXD2-AS1的增殖率为7.59%±0.615%，A172的增殖率为20.3%±1.12%，A172 si-FOXD2-AS1的增殖率为17.9%±0.720%。进行统计分析后，结果显示：lncRNA FOXD2-AS1能够促进胶质瘤细胞的增殖能力，且在48 h、72 h和96 h三个时间点差异有统计学意义(如图1A)。平板克隆形成实验发现，U251的克隆形成数为119.3±11.0，U251 si-FOXD2-AS1的克隆形成数为90.33±7.51，A172的克隆形成数为162.3±50.2，A172 si-FOXD2-AS1的克隆形成数为21.00±2.65。如图1B所示，沉默lncRNA FOXD2-AS1后克隆形成数明显降低，提示沉默FOXD2-AS1后能够有效降低胶质瘤细胞U251和A172的克隆形成能力。

control组vs.si-FOXD2-AS1组* *P<0.01,*P<0.05

2.2 LncRNA FOXD2-AS1促进胶质瘤细胞的迁移能力

如图2显示，A172对照组穿过上室的细胞数为377.67±61.51，沉默FOXD2-AS1后穿过上室的细胞数为196.67±23.46；U251对照组穿过的细胞数为134.33±32.72，沉默FOXD2-AS1后穿过上室的细胞数为43.000±15.13，即沉默FOXD2-AS1后穿过上室的细胞数较对照组明显减少，即FOXD2-AS1促进胶质瘤细胞的迁移能力。

control组vs.si-FOXD2-AS1组*P<0.05,* *P<0.01

3 讨论

LncRNA参与基因表达调控的多个过程，在肿瘤中起促癌或抑癌的作用，与肿瘤细胞增殖、凋亡、浸润与转移等多个恶性生物学过程密切相关[5]。有报道称，lncRNA FOXD2-AS1在肿瘤中表达上调且促进肿瘤的发生发展。Zhang等[6]研究发现lncRNA FOXD2-AS1在甲状腺乳头状癌中高表达，且与不良预后息息相关；Zhu等[7]研究证实，lncRNA FOXD2-AS1可作为大肠癌诊断和治疗的潜在生物靶点；Su等[8]研究发现lncRNA FOXD2-AS1与膀胱癌的分期及复发相关，可作为预测膀胱癌复发的分子标记物。本研究结果显示沉默FOXD2-AS1基因能够有效降低胶质瘤细胞U251和A172的增殖率和克隆形成数，即lncRNA FOXD2-AS1促进胶质瘤细胞的增殖。Transwell小室结果显示lncRNA FOXD2-AS1有促进胶质瘤细胞的迁移能力。综上所述，我们的研究表明lncRNA FOXD2-AS1能促进胶质瘤细胞的增殖及迁移，进而促进胶质瘤的恶性生物学行为。因此，lncRNA FOXD2-AS1可作为胶质瘤的一个分子标记物，为胶质瘤的基因靶向治疗提供一个潜在靶点。