人毛发中苯丙胺类毒品检测方法的研究进展

任冠恒，燕启江，唐鹰，吴君金，张静红，宋健文，刘宁国

（1.广东金域司法鉴定所，广东 广州 510220；2.广东司法警官职业学院，广东 广州 510430；3.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）

苯丙胺类兴奋剂是指以苯丙胺为母体结构的一类人工合成的、具有中枢神经系统兴奋作用的化合物。常见的苯丙胺类兴奋剂有苯丙胺（amphetamine）、甲基苯丙胺（methylamphetamine），还有苯环上和（或）其N位上被其他官能团所取代的化合物，如3，4-亚甲二氧基安非他明（3，4-methylenedioxyamphetamine，MDA）、3，4-亚甲二氧基甲基安非他明（3，4-methylenedioxymethamphetamine，MDMA）等[1]。该类苯丙胺类兴奋剂具有成瘾性、中枢神经兴奋、致幻[2]等药理、毒理学特性，已被列入联合国禁毒条例的管制中，被认为是非法毒品，近几十年来其滥用在全世界范围内不断增长和蔓延。近年来，国内外毒品市场上出现了一类新型的、结构和药效与苯丙胺类兴奋剂相似的药物，称为苯丙胺类兴奋剂策划药。该类策划药为苯丙胺类化合物的β酮衍生物，具有与苯丙胺类药物类似的刺激作用[3]。目前，我国苯丙胺类毒品的滥用已造成严重的社会问题，由于苯丙胺类毒品人工合成简单，大量结构相似的苯丙胺类新型毒品泛滥于各种娱乐场所，给法医毒物鉴定工作带来了极大的挑战。此外，该类毒品具有半衰期短、代谢速度快、体内含量低和化学性质不稳定等特点，而常规的毒物检材（如血液、尿液等）仅适用于短期体内滥用药物的检测，人的毛发具有易保存、稳定、检测时限长和分段分析可以反映较长时间的用药史等优点，弥补了体液检材的不足[4]。本文旨在介绍近年来人毛发中苯丙胺类毒品检测方法的主要研究进展。

1 运用毛发检材的优越性

检验苯丙胺类毒品的常规检材为体液检材，但血液和尿液的检材只能反映收集样品前的1～3d苯丙胺类毒品的吸食情况[5]，不能反映长期滥用信息。而毛发检材具有稳定、易保存、不易作假、检测时限长等优点，可提供吸毒者吸食苯丙胺类毒品的时间和信息，越来越受到法庭科学工作者的重视[6-7]。研究[8]报道，药物进入毛囊细胞并不是单纯靠血流中药物的被动扩散，而是通过多种机制进行的。药物进入毛发主要通过以下三种方式：（1）在毛发形成期，药物通过被动扩散透过皮肤下的血管进入毛囊细胞；（2）毛发形成后，药物通过汗腺或皮脂的分泌进入毛干；（3）毛发长出皮肤后，外界环境的污染可以将药物带到毛发中。药物进入毛发后，随毛发的生长向前移动，一般人的毛发生长速度大约为每月1cm[9]。大部分药物结合毛发后可以稳定地存在而不发生代谢，检测时限可长达数月甚至数年。因此，通过毛发的分段分析可以大致推测过去一段时间内吸食苯丙胺类毒品的情况。毛发分析已成为提供法庭证据的重要手段[10]。

2 毛发的前处理方法研究

2.1 清洗

毛发清洗的目的是去除外界污染以及毛发表面的污垢和油脂。外界污染是造成假阳性结果的主要原因，而毛发作为吸毒认定的法庭证据，只是检验的标的物，仅仅考虑摄入体内而进入毛发的毒品，因此，毛发检材的清洗十分重要。迄今为止，对毛发的清洗还没有统一的操作规范。不同实验室用来清洗毛发的有机溶剂（丙酮[11]、二氯甲烷[12]、十二烷基磺酸钠[13]、甲醇[14]等）也不尽相同，清洗方法也不统一。在苯丙胺类毒品进入毛发的机制还没有完全明确之前，无论使用哪种溶剂清洗，都无法完全去除毛发中的外源性污染。如果在清洗液中发现有外部污染，根据清洗动力学可知外源性污染会因反复洗涤而被迅速清除，毛发内部的苯丙胺类毒品也会一并洗出，故洗涤的次数一般以2～3次为宜，否则会降低毛发中苯丙胺类毒品的浓度。毛发内部被分析物的检出量至少要超过最后一次毛发清洗液中被分析物检出量的10倍，则可以将外源性的污染忽略不计[15]。

2.2 研磨和水解

将毛发进行水解能有效地将药物释放出来，便于后续的检测。在水解之前，毛发一般先剪成1mm小段并进行研磨，以增大毛发的表面积，使毛发中的药物更大程度地释放出来。最常用的研磨方法是利用2.5mm镍铬合金钢珠与毛发一起涡旋研磨[16]，毛发越细碎越有利于提高药物的释放。毛发中苯丙胺类毒品的水解方法一般包括强酸水解、强碱水解、缓冲液浸泡法、酶水解和有机溶剂超声水解等。

酸水解法一般是将毛发在盐酸溶液中以一定的温度孵育过夜，必要时还可以进行振荡或搅拌，加速毛发中药物的溶解[17-18]。碱水解法是将毛发样本浸泡于NaOH溶液中，并对其进行加热，让毛发充分溶解，促使固化在角蛋白中的苯丙胺类毒品能够得到完全的释放[19-20]。与碱水解法相比，酸水解法较温和，成本低，也能满足苯丙胺类毒品从毛发中释放的效率，但所需的时间较长。而碱水解法条件剧烈，可以将毛发完全消化和溶解，使毛发中的苯丙胺类毒品完全释放，但所含的杂质相对比较多，且容易使结构不稳定的化合物在强碱条件下发生降解。

缓冲液浸泡法是利用磷酸缓冲液将毛发在一定温度和一定pH值下进行浸泡，使毛发中的药物溶解[21-22]。酶水解法是将毛发置于酶中低温水浴加热，该法在中性pH值下进行[23-24]。这两种方法水解条件都比较温和，较少引起不稳定药物的降解，但缓冲液浸泡法使苯丙胺类毒品从毛发中释放的效率不高，而酶水解法不仅反应条件温和，而且能彻底将毛发中的苯丙胺类毒品释放，但其成本较高，且容易产生杂质。

有机溶剂超声水解法一般以甲醇为溶剂、超声振荡为主[25-27]。研究人员在毛发样本中加入甲醇，在50℃的水浴中超声溶解2h，然后以9000×g离心10min，将有机相转移到小瓶中，氮气吹干[28]。该方法依靠超声的震荡，能将毛发中的苯丙胺类毒品释放出来，条件温和，最大程度地降低苯丙胺类毒品在毛发中的降解。但有机溶剂超声水解法的缺点是释放不够完全且杂质较多。有研究[29]考察了毛发的碱性条件水解、酸性条件水解及有机溶剂超声提取等方法，用相同的方法萃取、检测，通过苯丙胺类毒品与内标的峰面积比来比较不同方法的水解效果，最后确定了将毛发在1mol/L的NaOH溶液中于75℃水浴加热30min，在水解液中加入少许KCl，再加入氯仿溶液50 μL这种方法为最佳水解方法。

2.3 提取

含有苯丙胺类毒品的毛发经过水解后，一般采用固相萃取和液相萃取进行提取净化。固相微萃取（solid-phase micro-extraction，SPME）技术是一种新型的样品前处理方法。该方法是在无溶剂条件下一步完成取样、萃取和浓缩，不但不会对环境造成污染，而且大大简化了样品预处理过程，提高了分析速度和灵敏度[30]。SPME的原理是将固相萃取头置于溶液或者顶空中，使样品中的待测物与固相萃取头达到平衡，这样待测物就富集到固相萃取头上。SPME用于苯丙胺类毒品的提取分离，通常与气相色谱联用，方法是待萃取头平衡后，将其取出并插入气相色谱汽化室，热解吸涂层上吸附的苯丙胺类毒品。KOIDE等[31]将顶空固相微萃取技术与气相色谱仪联用，把毛发样本置于75℃水浴中，用NaOH溶液进行消化水解约5 min，待温度降至室温后，SPME装置里萃取器的针头穿过小瓶的硅橡胶聚四氟乙烯膜（polytetrafluoroethylene，PTFE），此时针头里涂了固相微萃取涂层的萃取纤维会伸出针管，在55℃下暴露于小瓶的顶空气体中20min，待两相达到平衡后将萃取纤维缩回针头，把针头移离小瓶并快速插入到气相色谱进样口的汽化室中，在220℃的温度下将苯丙胺和甲基苯丙胺热解吸30s。被萃取的毒品在汽化室内解吸后，靠流动相将其导入色谱柱，完成提取、分离、浓缩的全过程。该方法能快速检测人毛发中苯丙胺与甲基苯丙胺，最低检测限可达0.1 ng/mg和0.4 ng/mg，能有效消除杂质的干扰及基质的影响。

液相微萃取（liquid-phase micro-extraction，LPME）是液相萃取中发展最快的新技术之一，克服了传统液-液萃取的繁琐、浪费、污染等缺点，具有消耗溶剂少、萃取效率高、富集倍数大、操作简便等优点。其基本原理是待测物在样品与微升级的萃取溶剂之间达到分配平衡，从而实现溶质的微萃取[32]。近年来，LPME也有用于毛发中苯丙胺类毒品的提取，取得了不错的分离效果，主要包括动态液相微萃取（dynamic liquidphase micro-extraction，dynamic LPME）和中空纤维液相微萃取（hollow fiber-liquid-phase micro-extraction，HF-LPME）。

Dynamic LPME是用微量进样器抽取一定量的溶剂，将微量进样器针头浸入到含有待测物的水样中，抽取水样，停留一定时间，让水样中的待测物分配进入进样器内壁上的有机溶剂相，而后推出水样但不推出溶剂，如此反复数次，最后将有机溶剂相进入气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪分析[33]。利用该方法检测毛发中的苯丙胺类毒品不仅操作简单、快速、灵敏，而且通过不断更换水相增大了表面积，提高了萃取效率。朱丹等[34]采用碱性条件消解毛发，动态液相微萃取的技术提取毛发中的待测物，萃取后直接吸取下层氯仿溶液，在微波条件下进行衍生化反应，然后联合应用GC-MS法快速检测了毛发中4种苯丙胺类毒品，其中苯丙胺检测限为1 ng/mg，甲基苯丙胺、3，4-（亚甲二氧基）-苯丙胺和3，4-（亚甲二氧基）-甲基苯丙胺检测限可达500pg/mg。

HF-LPME是将多孔的中空纤维作为有机溶剂的载体，有机溶剂在纤维壁孔中形成液膜进行传质，原理类似于膜分离液相萃取法，在多孔的中空纤维中进行萃取，并不与样品溶液直接接触，避免了复杂样品中基质对分析物或萃取剂的污染[35]。该技术用于毛发中苯丙胺类毒品的提取不仅操作简单快速、样品前处理少，而且有机溶剂消耗少，是一项对环境友好的新型样品前处理技术。DO NASCIMENTO PANTALEÃO等[36]采用HF-LPME和GC-MS联用的方法，快速地对人毛发中的苯丙胺类物质进行定量检测，最低定量限均达0.05 ng/mg，远远低于阈值（0.2 ng/mg）。该研究将毛发剪成1 mm小段后用NaOH进行消化水解，然后置于70℃水浴中15min，冷却至室温，然后用中空纤维膜对被测物进行萃取。中空纤维孔壁中填充十二烷基乙醚，作为有机中间相，而纤维膜内腔为0.1mol/L的盐酸，作为水相接受相。中空纤维膜利用U型装置引入样品溶液中，纤维膜两端分别连接两支微量进样器，方便向纤维膜内腔中注入接受相以及萃取结束后导出接受相。萃取会在混匀频率为1 000 r/min的混匀仪中进行，45 min后萃取结束，从纤维膜中导出接受相，并用氮气吹干。吹干后，残渣用V（三氟乙酸酐）∶V（乙酸乙酯）=50∶50在70℃下浸溶30min，冷却后在40℃下用氮气吹干，然后用乙酸乙酯复溶，最后，取1.0μL溶液进样到GC-MS系统中。

3 分析方法

目前，国内外对苯丙胺类毒品的理化检测多采用免疫分析法、GC-MS、液相色谱-质谱（liquid chromatogram-mass spectrometry，LC-MS）法和毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）等方法。

免疫分析技术首次用于毛发中毒品的分析是1979年BAUMGARTNER等[37]用放射性免疫法成功测试了吸毒者毛发中的海洛因及其代谢物，并推断吸毒者的用药时段。此后，科学研究者对免疫分析技术进行不断地研究，目前，在毒品分析中应用最多的是荧光偏振免疫分析（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）法。FPIA是使用荧光基团代替放射性同位素作为标记物，属于竞争性的免疫分析方法，检测荧光标记抗原在结合特异性的抗体前后荧光偏振（fluorescence polarization，FP）值的变化[38]。CHEONG等[39]应用FPIA成功筛选出头发中的甲基苯丙胺。研究人员用甲醇润湿纸巾后将毛发拭擦两遍，挥干后将毛发剪成5 mm小段，并浸入酶消化液中，在56℃下水解不超过4h。毛发消化完全后将温度升至100℃，保持1 min，使酶失去活性。溶液冷却至室温后，离心，取上清液进行FPIA分析。实验结果显示，FPIA筛选方法的真阳性率为100%，真阴性率为96.7%，FPIA和GC-MS之间的相关系数为0.91。该方法检测毛发中的苯丙胺类毒品，不但重复性好，而且灵敏度和特异性接近色谱水平，是一种快速可靠的免疫分析法。

气相、液相色谱的快速普及，大大推动了毛发分析的发展。特别是GC-MS和LC-MS法因其灵敏度高和准确度高的特点，已成为检测毛发中苯丙胺类毒品的主要方法。GC-MS发展较早，也较为成熟，分析速度快，而且有标准物质数据库进行比对，是较为常用和理想的分析方法。该法利用气相色谱的高效分离性和质谱的高灵敏性，对易挥发、极性小、热稳定性好的物质实现快速、准确的分析。而LC-MS则适用于极性较大，较难气化以及热稳定性差的物质。苯丙胺类毒品有两种光学异构体，分别为L-型和D-型，目前毒品市场大部分为D-型的异构体，其不但半衰期长，而且对人体大脑中枢神经的兴奋作用大大强于L-型，因此，将苯丙胺类毒品的两种光学异构体进行分离鉴别有重要的意义。有文献[40]报道，用pH=10的饱和碳酸盐缓冲液对毛发中的苯丙胺及其类似物进行超声萃取，加入衍生化试剂三氟乙酰-脯氨酰氯，然后用己烷直接提取，再利用GC-MS法在SIM模式下对苯丙胺及其类似物的R和S构型的对映异构体进行快速分离和检测，苯丙胺、甲基苯丙胺和MDA的最低检测限可达0.1 ng/mg，而MDMA和亚甲二氧基乙基苯丙胺（methylendioxy ethylamphetamine，MDEA）最低检测限达0.2ng/mg，建立了一种快速、高效的从毛发中分离并检测苯丙胺类对映异构体的分析方法。SHU等[41]把毛发浸泡在0.1 mol/L的HCl中以53℃消化过夜，采用固相萃取的方式将毛发中的甲基苯丙胺提取分离，萃取液经过衍生化后利用非手性液相色谱柱-串联质谱的方法直接分离和检测毛发中甲基苯丙胺的对映异构体。该方法只需通过获得R构型与S构型甲基苯丙胺的比例就能推导出组成百分比，无需将每个对映体进行定量，是一种低成本、快速、高效的分析方法。

除了LC-MS和GC-MS等应用较广泛的分析方法，CE法是根据待测组分的分子量和带电荷量，在电场驱动力的作用下达到富集和分离，最后经检测器检验分析的一种方法。CE分离效率高，易于操作，也被成功地用于毛发中苯丙胺类毒品的检测。孟品佳[42]建立了毛细管区带电泳的在线场放大样品堆积法成功分析毛发中的苯丙胺类毒品，该方法利用缓冲体系与样品溶液体系电导率的差异，实现样品在毛细管中的浓缩。在实验中，研究者在样品与缓冲液间引入了一水柱，水柱的电导率低于缓冲液，样品随溶液进入后，由于样品溶液和水柱的电阻大，形成高电场，样品离子迅速迁移至水柱与缓冲液的界面，并在界面富集。利用该方法对4种苯丙胺类毒品进行了分离和定量测定，检测灵敏度提高约1000倍。GOTTARDO等[43]采用毛细管区带电泳-电喷雾电离-离子阱质谱（capillary zone electrophoresis-electrospray ionizationion trap mass spectrometry，CZE-MS）的方法快速分析了人毛发中的苯丙胺类毒品。将剪碎的毛发样本在0.1mol/L的HCl中45℃消化过夜，用NaOH中和后进行液-液萃取，收集有机层并用氮气流吹干后，用双蒸水将残渣复溶。毛细管区带电泳技术是用裸露的熔融石英毛细管实现分离的，以pH=9.5、浓度为25 mmol/L的甲酸铵作为缓冲液，电泳电压为15 kV，在场放大样品堆积的条件下，以7 kV的电动进样电压维持30 s，实现待测物的分离。分离结果显示，MDA和MDMA在20 min内完成分离，最低检测限低于0.1ng/mg。

4 小 结

毛发作为继血液、尿液之后特殊的生物检材，已成为法医毒物分析的常规检材，并已得到法庭的承认和采纳。毛发的前处理方法经过前人不断的深入研究，对毛发中苯丙胺类药物的提取分离取得了不错的成绩，检测分析也从最初的免疫分析法到现在的色谱-串联质谱等方法，经过几十年的快速发展，其结果更加准确、灵敏，并逐步实现了系统化和规范化。但毛发分析毕竟是一项年轻的鉴定技术，毛发中苯丙胺类毒品分析研究还需要不断的优化和探索，为禁毒执法工作提供有力的技术支撑。