台盼蓝、次甲基蓝及健那绿在猪精子活率测定中的比较研究

2019-03-24杨琼邓继辉王振华俞宁

四川畜牧兽医 2019年3期

关键词：活率载玻片染上

杨琼，邓继辉，王振华，俞宁

（成都农业科技职业学院，四川温江 611130）

根据某些活体染料能够区别细胞死活的特点，本试验利用台盼蓝、次甲基蓝、健那绿三种染液分别对猪精子进行染色，在不同的染色条件下统计数据，制表分析，筛选出合适的染料、合理的染色时间和染色浓度，从而使精子更容易观察到，测得的精子活率更为准确。

1 材料与方法

1.1 精液的采集和处理本试验使用的猪精液来自崇州某猪场。借助光学显微镜将精液高倍稀释（采用BTS稀释液），在显微镜下用肉眼观测法估测，以清楚地观察到精子轮廓且精子间有一定的间距为宜[1]。将稀释后的猪精液放入17℃冰箱中保存，待用。

1.2 主要试剂台盼蓝、次甲基蓝、健那绿购自上海士锋生物科技有限公司；PBS缓冲液（pH值7.4）、0.9%NaCl溶液、BTS 稀释液（pH 值 7.2）来自四川农业大学动物遗传与胚胎工程实验室。

1.3 主要仪器设备恒温恒湿箱、恒温台、冰箱、超净工作台、实验室干燥箱、超声波清洗机、电子天平、计时器等，Zealway全自动高压灭菌锅、奥林巴斯CH-2正立显微镜等。

1.4 方法

1.4.1 实验准备工作将载玻片、盖玻片在酸缸中浸泡至少1周，捞出后用清水冲洗掉酸液，反复几次。将玻片放入超声波清洗机中清洗20min（20℃），之后再用纯水漂洗，以不挂水珠为准，晾干。超净工作台经过紫外线照射至少15min，紫外线消毒后，将紫外线杀菌灯换成工作灯，打开风机。实验人员戴上干净的一次性聚乙烯手套和口罩，用酒精喷雾器喷洒手套外表面、移液枪枪头和枪头盒，消毒灭菌，用酒精棉球将台面擦拭干净，结束后再打开紫外灭菌灯，灭菌30min。

使用干净的牛皮纸将载玻片、盖玻片、枪头盒包好，用马克笔标记姓名、指导老师、实验室、日期等信息，将包好的物品放置在高压蒸汽灭菌锅中灭菌（30min，120℃）。灭菌完成后，待显示面板显示压力降到0Pa，显示温度＜80℃，才能开盖，取出物品后关闭电源，在干燥箱中烘干，24h后取出、待用。

1.4.2 溶液配制

（1）台盼蓝染液的配制：用电子天平称取4g台盼蓝，加入PBS缓冲液至100 mL，溶解、过滤后，装入塑料试管中，用塑料杯封口膜密封，包裹锡箔纸，4℃保存。使用时用PBS液稀释成0.2%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%的浓度梯度。

（2）次甲基蓝染液的配制：取次甲基蓝2.0g，加0.9%NaCl溶液100mL，溶解后过滤，配制成2%次甲基蓝染液。使用时用生理盐水稀释成0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.5%、2%的浓度梯度。

（3）健那绿染液的配制：将0.5g健那绿溶解于50mL生理盐水中，加温至30～40℃，使其充分溶解，经滤纸过滤后，装入塑料试管中，用塑料杯封口膜密封，包裹锡箔纸。按照此法将健那绿分别配成0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%的浓度梯度，再用生理盐水将1%的健那绿染液稀释为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%的浓度梯度。

（4）BTS稀释液的配制：依次称取葡萄糖3.700g、柠檬酸钠 0.300g、EDTA 0.125g、碳酸氢钠0.125g、KCl 0.075 g溶解到100 mL灭菌水中，然后用氢氧化钠调节pH值到7.2，使用时加青霉素125μL、链霉素 200μL。

1.4.3 染色方法

（1）台盼蓝抹片染色法：染液、显微镜玻片先在37℃恒温箱中预热[2]。将精液样品充分混匀，用移液枪（量程为 10～100 μL）吸取 5 μL 精液样品和5μL台盼蓝染液于微量离心管中，搅拌混匀，置于37℃恒温箱，待镜检。

镜检时摇匀待测液，取5μL滴于载玻片的右端，取另一张边缘光滑平直的载玻片呈35°角自待测液的左面向右接触，待测液即呈条状分布在两个载玻片接触边缘之间，将上面的载玻片贴着平置的载玻片表面，自右向左移动，带着待测液均匀地涂抹在载玻片上，切忌直接将待测液“推”过去，人为造成精子损伤[3]。置于400倍显微镜下观察，随机选取多个视野，对染色死亡细胞与非染色存活精子数量进行计数[4]，保证所有视野中的精子总数≥200个，根据“精子活率=所有视野中存活精子数目/所有视野中总精子数目”公式计算精子的活率，重复数次，取平均值。

（2）台盼蓝滴压染色法：用移液枪取上述待测液3μL于载玻片上，然后盖上盖玻片（22 mm×22 mm），直接用400倍光学显微镜检验，统计染色精子数目和未染色精子数目，计算精子的活率，重复数次，取平均值[4]。

（3）次甲基蓝抹片染色法：用移液枪吸取5μL精液样品和5 μL次甲基蓝染液于微量离心管中，使用移液枪搅拌、混匀，然后吸取5μL于37℃载玻片上，待反应30～40s后，用另一洁净载玻片制作抹片（抹片方式同台盼蓝抹片染色法），然后镜检、计数，计算精子活率。

（4）次甲基蓝滴压染色法：将稀释后的猪精液混匀，取2μL中层精液与2μL次甲基蓝染液于37℃载玻片上，在载玻片上用移液枪充分搅拌均匀，盖上盖玻片，反应 30～40 s，然后镜检、计数，计算精子活率。

（5）健那绿染色方法：同次甲基蓝染色法。1.4.4 制作空白对照组将未加染液的精液样品单独制片，置于血球计数板上，在恒温（37～38℃）载物台上观察，对不活动的精子进行计数，然后置于恒温干燥箱内（100℃ 2 min）处死所有精子，并计数[5]。精子活率=（所有视野中总精子数目-不活动精子数目）/所有视野中总精子数目。

1.5 统计分析取稀释后的精液用不同浓度的台盼蓝（0.2%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%）、次甲基蓝（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.5%、2%）、健那绿（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%）于室温下染色，台盼蓝染液又分设 5、10、15、20 min 4个不同的染色时间。染色结束后镜检，计算各样本的精子活率。试验数据用“平均值±标准差”表示，用SPSS22.0软件进行数据分析，采用Duncan's单因素方差分析比较不同染液浓度及不同染色时间下的精子活率。

2 结果与分析

2.1 精子的染色特征用台盼蓝染液对猪精液染色后，在显微镜下观察到活精子的细胞膜界限分明，呈无色透明状；死精子体积较大，着蓝色，细胞界限模糊难辨。经次甲基蓝染色后，可以观察到绝大部分精子被染上色，整个精子着蓝色，精子细胞膜界限分明，极少数精子透明不着色。经健那绿染色后，可以观察到绝大部分精子被染上蓝色，细胞界限分明，精子尾部中段略膨大，极少数精子不着色，无色透明。

2.2 不同染色条件下猪精子活率的比较

2.2.1 台盼蓝染色后精子活率的比较采用Duncan's单因素方差分析，比较不同染液浓度及不同染色时间下的精子活率，结果如表1所示。

同一染色时间下，随着台盼蓝染液浓度的提高，精子头部着蓝色的精子数目逐渐增加，由此判断死精子数目不断增加，得出猪精子活率逐渐降低，且降低的幅度大（P＜0.05），表明染液浓度对精子活率的影响较大，但染色15 min以内，0.35%、0.4%、0.45%浓度之间的差异不明显。在相同染色浓度下，作用时间越长，被染上色的精子数目越多，即死精子数目增多，精子活率下降。5～10 min内，精子活率下降幅度小（P＞0.05），10 min之后，随着时间的延长，精子活率下降幅度增大（P＜0.05），表明染色时间对精子活率的影响较大。将测得的精子活率与空白对照组进行对比，得出0.4%台盼蓝染色15 min与对照组差异不显著（P＞0.05）。对照组的精子活率为77.87%±0.33%。2.2.2 健那绿、次甲基蓝染色后精子活率的比较不同染色浓度下，次甲基蓝和健那绿染色后精子活率的测定结果如表2所示。

表1 不同浓度台盼蓝在不同染色时间下测得的精子活率

次甲基蓝染液和健那绿染液对精子的染色时间为30～40 s，光学显微镜下观察到视野中绝大多数精子被染上色，极少数精子无色透明、不着色，根据着色情况判断精子的死活，即染色30～40s精子全部死亡。与对照组相比，次甲基蓝、健那绿染色后的精子活率不超过4%。

表2 次甲基蓝、健那绿染色后精子活率的测定结果

3 讨论

精子质膜是精子最外层的细胞结构，膜的完整性是精子维持正常生理功能的基础和基本条件，因此精子膜的完整性常作为评价精子质量的最基本指标，而活体染色剂是目前判断精子质膜完整性最简便的方法之一，台盼蓝则是其中常用的精子活体染色剂之一[6]。

3.1 本次试验对不同染色条件下的精子活率进行了比较，发现染色时间越长、染液浓度越大，精子活率越低。台盼蓝染色时间从5min延长到10 min时，测得的精子活率差异不显著，表明染色时间在10min以内的染色效果差异不明显。染色时间越短，精子染色不充分，部分死精子没有染上色，导致测得的精子活率高于实际精子活率。不同染液浓度下，精子活率差异显著。染液浓度越高，染色越充分，染上色的死精子数目越多，测得的精子活率越低，但染液浓度过大对活精子也有损害，最终使测得的精子活率低于实际精子活率。

3.2 次甲基蓝染液常用于区分酵母细胞的死活，且区分酵母细胞死活的最适染色时间为8 min、最适染色浓度为2%。为了探究次甲基蓝是否可用于精子活率的测定，前期设置的时间梯度为3、5、8、12 min，浓度梯度为 1%、1.5%、2%、2.5%、3%。镜检观察到，绝大部分精子染上了蓝色，随着浓度的增加，染色背景越深，越不易区分染色与否，染上色的精子数目不随着时间的变化而变化。调整染色浓度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.5%、2%，采用立即染色的方式，即在 30～40 s范围内完成染色。结果显示：精子染色效果很明显，整个精子染上蓝色，细胞界限清晰，但是即使用低浓度的次甲基蓝染色，视野中的绝大部分精子也被染上了蓝色，根据染色情况，计算出的精子活率不超过4%，而空白对照组的精子活率为87.67%。所以，次甲基蓝不能用于猪精子活率的测定。

3.3 健那绿属于活体染色剂，专一性染色线粒体，线粒体中的细胞色素氧化酶使健那绿保持在氧化状态呈现蓝绿色，而线粒体周围细胞质中的染料被还原为无色，从而使线粒体显色[7]。为了探究健那绿是否可用于精子活率的测定，前期设置的时间梯度为5、10、15 min，浓度梯度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%。采用抹片法或者滴压法制片后，观察到视野中精子混为一体，无法辨别精子形态，健那绿染液吸附精子呈团状，背景杂乱不易观察，且浓度越大，絮状物越多。调整染色浓度为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.20%，于30～40s内完成染色。镜检比较各个浓度下的染色情况，发现当浓度大于0.08%时，染色效果差，精液和染液聚集，精子形态不易辨别；当染液浓度小于0.08%时，染色效果好，可以清晰地看到精子颈部、尾部中段膨大，精子染上蓝色，细胞界限清晰。随着浓度降低，精子染色越好，但计算得出的精子活率不超过4%，而空白对照组的精子活率为72.37%。所以，健那绿也不能用于猪精子活率的测定。

次甲基蓝和健那绿在即染方式下几乎对所有精子都染上色，且视野中没有活动的精子，分析原因可能是精子对次甲基蓝和健那绿的毒性很敏感，导致染色30～40s内精子全部死亡，所以通过这两种染料染色与否来判断精子死活并计算精子活率，是不可行的。