硒、锌元素配施对紫花苜蓿产量、植株体内硒锌积累和氨基酸含量的影响

田春丽,李斌,刘芳,赵颖,刘世亮,介晓磊,4,胡华锋

(1.河南农业大学资源与环境学院,河南 郑州 450002;2.河南农业职业学院,河南 中牟 451450;3.河南省农业厅中药材生产技术服务中心,河南 郑州 450008;4.商丘师范学院,河南 商丘 476000;5.河南牧业经济学院,河南 郑州 450011)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上广泛分布且享有盛誉的优良牧草，因其产量高，适口性好，且粗蛋白、维生素和矿物质含量丰富，氨基酸组成比较齐全，素有“牧草之王”的美称。在紫花苜蓿种植生产过程中，大量元素肥料(氮、磷、钾肥)和微量元素肥料的配合施用不仅可以提高苜蓿的产量，也能提高其中的微量元素，从而有效地补给畜禽动物，改善其营养条件。研究认为，硒是人类和动物生命活动必需的微量元素。然而我国2/3地区属缺硒地区，其中含量≤0.02 mg·kg-1的占29%，为严重缺硒地区[1]。通过土壤施硒，提高植物体内硒含量，从而提高食物链硒水平，增加人与动物对硒的摄入量是人—畜补硒的重要途径。近年来，有关硒对牧草的影响已引起了部分学者的关注。Hu等[2]研究表明，适量硒可促进紫花苜蓿生长，增加产量，并可生产富硒紫花苜蓿产品；翁伯琦等[3]研究表明，施硒能提高圆叶决明(Chamaecristarotundifolia)生长、改善品质，并提高其根瘤固氮能力，随施硒用量的增加，植株硒含量增幅可达302.7%～1778.4%。另外，有研究表明，缺锌会严重影响紫花苜蓿产量和品质，锌作基肥能提高紫花苜蓿当年的产量，刘世亮等[4]研究表明，喷施硫酸锌能显著提高紫花苜蓿草产量，以喷施浓度为500 mg·L-1效果最好，并提高相关品质指标，但喷施浓度过高，则会抑制紫花苜蓿的生长，降低其品质。

牧草的氨基酸含量和组成是评价其品质的重要指标。氨基酸含量的高低、组成种类及比例直接影响到牧草最终的品质以及家畜的生长及生产效率。前人对不同种质材料牧草中总氨基酸和各种游离氨基酸含量的研究有较多的报道[5-7]。但从施肥和植物营养角度研究不同营养元素对紫花苜蓿氨基酸组成特点和评价其营养价值的报道尚不多见。因此，本试验以紫花苜蓿为研究对象，通过在缺硒缺锌及硒锌有效性较低的石灰性潮土上基施硒、锌微肥的盆栽试验，研究硒、锌单施和配施对紫花苜蓿产量、硒锌积累量和氨基酸组成的影响，并采用非生物学评价法中的氨基酸评分(amino acid score, AAS)、化学评分(chemical score, CS)及必需氨基酸指数(essential amino acid index, EAAI)3个指标，对其营养价值和饲用价值进行评价，以期为紫花苜蓿合理施用硒、锌微肥，了解微肥施用对提高紫花苜蓿品质的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

供试土壤采自河南省农业高新科技园区的石灰性轻壤质潮土。土壤(0～20 cm)基本理化性状为：土壤有机质含量为10.7 g·kg-1，碱解氮为55.2 mg·kg-1，速效磷为11.5 mg·kg-1，速效钾为85.0 mg·kg-1，有效锌0.64 mg·kg-1，有效硒0.008 mg·kg-1，pH值为7.88。刘铮[1]曾指出，土壤硒含量≤0.02 mg·kg-1时为严重缺硒，锌含量为0.5～1.0 mg·kg-1为缺锌，可见该区土壤属于严重缺硒缺锌土壤区。

1.2 供试材料

供试氮肥为尿素[CO(NH2)2，含N 46%]；钾肥为硫酸钾(K2SO4，含K2O 50%)；磷肥为过磷酸钙(含P2O512%)；锌肥为分析纯七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)；硒肥为分析纯亚硒酸钠(Na2SeO3·5H2O)。

供试紫花苜蓿品种为三得利，该品种是从美国引种的优质牧草品种之一，其春季返青早，生长迅速，夏秋季生长旺盛，再生速度快，产量高；茎秆柔嫩、适口性好、蛋白质含量高、消化率好；抗冻害能力强，秋眠级数4.0，且抗病虫害和抗倒伏能力强，具有很高的社会经济效益。

1.3 试验设计

试验于2012年3—8月在河南省农业高新科技园区网室进行。采用锌、硒两因素三水平完全设计。锌和硒三水平分别为：每kg干土施纯锌(Zn)量折合为0、0.10、0.40 g·kg-1(分别用Zn0、Zn1、Zn2表示)，每kg干土施纯硒(Se)量折合为0、0.30、1.80 mg·kg-1(分别用Se0、Se1、Se2表示)，共9个处理组合，分别为：1)对照(Se0Zn0)；2)低锌(Se0Zn1)；3)高锌(Se0Zn2)；4)低硒(Se1Zn0)；5)低硒低锌(Se1Zn1)；6)低硒高锌(Se1Zn2)；7)高硒(Se2Zn0)；8)高硒低锌(Se2Zn1)；9)高硒高锌(Se2Zn2)，每个处理重复3次，共27盆。各处理均基施氮、磷、钾肥和腐殖酸(富啡酸)肥(河南省化学研究所提供，纯度≥50%)。氮、磷、钾及富啡酸(fulvic acid, FA)用量(风干土计)分别为N 0.2 g·kg-1、P2O50.35 g·kg-1、K2O 0.33 g·kg-1、FA 0.25 g·kg-1，在装盆时一次性施入。

盆栽试验用盆为白色不透光塑料盆，每盆装干土10 kg。装盆前，先取1 kg干土分别与硒、锌微肥混匀(硒以Na2SeO3·5H2O溶液形式加入，锌以ZnSO4·7H2O粉末形式加入)，再与氮磷钾及富啡酸混匀，然后与剩余的盆栽土混匀。装土过程中保证土壤松紧合适；装土9.0 kg以后，灌水2000 mL，水分完全入渗后，每盆均匀播种紫花苜蓿种子30～40粒，并将剩余土覆盖于土面，覆土厚度约1.5 cm。苗期间苗至10株，在植株生长期间，适时松土、浇水，防治虫害。

1.4 测定项目及方法

1.4.1样品采集 分别于2012年的6月27日、7月29日(初花期)取样刈割，刈割时留茬5 cm左右，刈割后立即称鲜重。从所取新鲜样品中随机取150 g，先用自来水冲洗，再用去离子水冲洗干净，用粗滤纸擦干，于105 ℃杀青15 min后，于65 ℃烘干至恒重，计算含水率，按下面的公式计算每盆地上部的干草产量。粉碎过20 mm筛，两茬混合均匀后备用。

每盆干草产量(g)=鲜草量(g)×(1-含水率)

1.4.2植株硒、锌的测定 植株全硒、全锌分别采用GB/T13883-2008法和湿灰化法测定[8]。硒(锌)积累量按“硒(锌)积累量=硒(锌)含量×干物质”进行计算。

1.4.3紫花苜蓿氨基酸含量和组分的测定 准确称取植物样200～500 mg于试管中，加入10 mL 6 mol·L-1的盐酸溶液(含0.5%巯基乙酸)进行水解，冷冻后抽真空，再充入氮气封口，将试管放入110 ℃的烘箱中水解22～24 h，冷却后过滤到50 mL容量瓶中，并用无离子水稀释至刻度，过滤。准确取10 μL样品液于5 mm×50 mm小试管中，真空抽干，加入20 μL衍生缓冲液，于混合器上振荡30 s，加入20 μL衍生试剂，封口振荡30 s，于60 ℃培养30 min，冷却后加入160 mL平衡缓冲液，振荡混合30 s。然后用氨基酸自动分析仪(日立L-8800，日本)检测紫花苜蓿中的17种氨基酸(除色氨酸)含量。

1.5 氨基酸品质评价方法

采用非生物学评价法。此类评价方法一般不需进行复杂而费时的动物试验，而是根据供试蛋白质的氨基酸组成及比例与参照蛋白质的氨基酸组成及比例进行比较分析，特别是根据其中所含必需氨基酸的组成及比例评价其价值，或根据经验方法进行测定。

1.5.1氨基酸评分(AAS) 将必需氨基酸(mg·100 g-1干重)含量换算为每克蛋白质中含氨基酸毫克数(除以占干重蛋白质分数)，然后根据Bano[9]的方法，与1973年联合国粮农组织/世界卫生组织(Food and Agriculture Organization/World Health Organization, FAO/WHO)[10]暂定氨基酸计分模式和以鸡蛋蛋白质作为理想蛋白质进行比较，即氨基酸评分为试验蛋白质中某一必需氨基酸占FAO/WHO评分模式中相应氨基酸含量的百分比。可按下式计算：

式中：Ax为待测蛋白质中某一必需氨基酸的含量；As为FAO/WHO评分模式中相应氨基酸含量。

AAS值越接近100，与评分模式氨基酸组成越接近，蛋白质价值就越高。

1.5.2化学评分(CS) 采用FAO在1970年推荐的方法[11]，用来测定评价待测蛋白质中某一必需氨基酸的相对含量(与其必需氨基酸总量之比)与标准鸡蛋白中相应必需氨基酸相对含量的接近程度。可按下式计算：

式中：Ax为待测蛋白质中某一必需氨基酸的含量；Ae为待测蛋白质中必需氨基酸的总含量；Ex为标准鸡蛋白中相应必需氨基酸的含量；Ee为标准鸡蛋白中必需氨基酸的总含量。

CS值越接近100，与标准蛋白的组成越接近，营养价值就越高。

1.5.3必需氨基酸指数(EAAI)的计算及评价参比物的确定 利用Penaflorida[12]评价饲料蛋白源时采用的公式计算EAAI值。

式中：aai为牧草中某种必需氨基酸占必需氨基酸总量的百分数；AAi为参比蛋白中该必需氨基酸占必需氨基酸总量的百分数；n为计算中涉及的必需氨基酸数。由于 EAAI 反映了饲料蛋白源的必需氨基酸组成与喂养对象的必需氨基酸组成的拟合程度，因此可以用喂养动物蛋白为参比，用 EAAI 评价蛋白源对该动物的营养价值。

分别选用牛肉[13]、兔肉[14]及山羊肉[15]背肌最长肌氨基酸为参比，并根据冯东勋等[16]提出的标准评价牧草蛋白质的营养价值，即：当n=6～12时，EAAI>0.95为优质蛋白源；0.86≤EAAI≤0.95为良好蛋白源；0.75≤EAAI≤0.86为可用蛋白源；EAAI≤0.75为不适蛋白源。

1.6 数据处理方法

采用Excel 2013和DPS 7.05软件进行数据处理和统计分析，并采用Duncan新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同处理对紫花苜蓿干草产量的影响

由表1可知，除Se0Zn1(低锌处理)对草产量增产效果不显著外，其余施肥处理均使紫花苜蓿干草产量较对照(Se0Zn0)相比有所增加。第一茬各处理产量均高于第二茬各相应处理，其中第一茬干草产量占总干草产量的52.49%～55.94%。

在第一茬中，以Se1Zn1处理产量最高，其次为Se1Zn2、Se2Zn0，三者间差异不显著。在相同硒水平下，随锌施用量的提高干草产量也不同程度变化，在不同硒水平下变化规律不同：在单施锌肥(Se0条件下)时，高锌显著提高苜蓿干草产量，而低锌处理产量却有所降低；在低硒Se1条件下，配施锌肥极显著提高苜蓿干草产量，且随锌用量的增加先升后降， 以Se1Zn1处理的产量最高，达到23.5 g·pot-1；在高硒Se2条件下，产量随锌用量的增加而下降，且高硒低锌与高硒高锌两个处理间差异不显著。同样可以看出，不同施锌量时，硒对干草产量影响规律也不同： 在Zn0时，产量随施硒量的提高显著增产；在低锌及高锌条件下，配施硒也显著提高苜蓿产量。总体来看，硒锌配施对草产量增产效果明显优于微肥单施，以低硒条件下配施锌肥效果最好；单施硒肥增产效果好于单施锌肥，且草产量均随微肥用量增加而增加，说明硒是提高苜蓿干草产量的主要因素，锌仅起到次要作用，并且两者配施效果最好。

表1 硒、锌配施对紫花苜蓿地上部干草产量的影响Table 1 Effects of Se and Zn combined application on herbage yield of alfalfa (g·pot-1)

注：同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note:Bars with different capital letters show significant difference atP<0.01, and the different small letters indicate significant difference atP<0.05 by the Duncan-test. The same below.

第二茬中，苜蓿草产量大小顺序如下：Se2Zn1>Se1Zn1>Se2Zn0>Se2Zn2>Se1Zn2>Se1Zn0>Se0Zn2>Se0Zn1>Se0Zn0，但前5个处理之间差异均不显著。单施低硒处理Se1Zn0与单施高锌处理Se0Zn2与对照相比虽有显著增产，但增幅较低，分别仅为12.48%和6.78%，且两者之间无显著差异;与第一茬相似，单施低锌Se0Zn1处理与对照Se0Zn0差异不显著。不同处理间总干草产量变化规律与第一茬相似，以Se1Zn1、Se2Zn0、Se2Zn1处理产量较高，三者之间差异不显著，但与其余处理均有显著差异。

2.2 不同处理对紫花苜蓿硒、锌含量与积累量的影响

2.2.1对硒含量与积累量的影响 由表2可知，施硒能显著提高紫花苜蓿硒含量，且硒含量随硒施用量的增加呈直线上升，增幅高达181.82%～1127.27%，这与紫花苜蓿对硒具有较强的吸收和富集能力有关。在不施硒肥仅施锌肥时，苜蓿硒含量随施锌量的增加呈降低趋势，虽然低锌处理Se0Zn1与高锌处理Se0Zn2之间差异不显著，但两者的硒含量均极显著低于对照Se0Zn0，降幅依次为36.36%和45.45%。而低硒时，Se1Zn0、Se1Zn1、Se1Zn2处理的苜蓿硒含量均显著高于Se0Zn0处理，且三者之间均差异显著。可见，在施少量硒肥时，苜蓿硒含量显著提高，配施锌肥后极显著促进苜蓿对硒的吸收；高硒处理时，随施锌量的提高也显著地提高硒含量，并显著地高于Se0Zn0处理。总之，在严重缺硒地区通过土壤基施硒肥能有效提高紫花苜蓿硒含量，且对于富集能力较强的苜蓿而言，高硒并未出现中毒现象，同时，在低硒条件下，配施高锌使硒极显著富集于苜蓿体内，硒与锌表现为协同效应。

硒积累量不仅与紫花苜蓿硒含量有关，还与苜蓿生物量密切相关，由表2可见，紫花苜蓿硒积累量随硒施用量增加而迅速增加，硒积累量最高值出现在Se2Zn2处理，是对照处理积累量的15.07倍。同时也可以看出，在Se0情况下，紫花苜蓿硒积累量随锌施用量的增加而有所减少，但在有硒施入土壤情况下，紫花苜蓿硒积累量随锌施用量的增加而显著增加，说明无外源硒施入时，施锌抑制了紫花苜蓿对硒的积累，二者呈拮抗关系，而当硒和锌同时施入时，二者呈协同关系。

2.2.2对锌含量与积累量的影响 由表3可见，对于不施锌处理中，Se1Zn0及Se2Zn0的紫花苜蓿锌含量低于对照Se0Zn0， 表明单施硒抑制了苜蓿对锌的吸收，硒与锌表现为拮抗作用；在低锌和高锌处理中，紫花苜蓿锌含量均随施硒量的增加表现出先升后降趋势，表明适量施硒显著促进紫花苜蓿对锌的吸收，但过量施硒反而不利于苜蓿对锌的吸收。同时可以发现，在相同施硒量处理中，紫花苜蓿锌含量均随施锌量的增加而增加，说明基施锌可促进紫花苜蓿对锌的吸收，提高锌含量。

锌积累量与其含量和紫花苜蓿产量相关。由表3可见，锌含量最高值在Se1Zn2处理，因此该处理的锌积累量最高，其次为Se2Zn2处理，而且两者之间差异极显著，即在产量差异不大的情况下，紫花苜蓿Se、Zn含量的增加决定了紫花苜蓿Se和Zn的积累量。

表2 硒、锌配施对紫花苜蓿硒含量及积累量的影响 Table 2 Effects of Se and Zn combined application on Se content and accumulation of alfalfa

注：表中数据为两茬数值的加权平均值。下同。

Note:The data in the Table is the weighted average value of the two cuts values. The same below.

表3 硒、锌配施对紫花苜蓿锌含量及积累量的影响 Table 3 Effects of Se and Zn combined application on Zn content and accumulation of alfalfa

2.3 不同处理对紫花苜蓿氨基酸含量和组分的影响

2.3.1对紫花苜蓿氨基酸总量的影响 由表4可知，各处理紫花苜蓿总氨基酸含量变化幅度在15.88～18.89 g·100 g-1(以干重计)，氨基酸含量大小顺序如下：Se1Zn1>Se1Zn2>Se0Zn2>Se1Zn0>Se2Zn1>Se0Zn1& Se2Zn0>Se0Zn0>Se2Zn2。具体而言，Se1Zn1处理(18.89 g·100 g-1)、Se1Zn2处理(18.70 g·100 g-1)和Se0Zn2处理(18.27 g·100 g-1)分别比对照Se0Zn0(16.39 g·100 g-1)提高了15.3%、14.1%和11.5%(P<0.05，下同)，而Se1Zn0处理(17.86 g·100 g-1)与Se2Zn1处理(17.31 g·100 g-1)的增加幅度略低，分别为9.0%和5.6%，Se0Zn1处理(16.90 g·100 g-1)与Se2Zn0(16.89 g·100 g-1)的增幅更低，仅为3.11%和3.05%，而Se2Zn2处理反而以3.11%的幅度降至15.88 g·100 g-1。

2.3.2对各氨基酸含量及组成的影响 因为色氨酸需要单独的方法进行测定，故本研究只测得除色氨酸外的17种氨基酸含量。由表4可见，对17种氨基酸中至少4种含量及组成影响较大的处理是Se1Zn0、Se1Zn1、Se1Zn2和Se2Zn2，前3个处理提高了不同种类氨基酸含量及总氨基酸含量，与之相反的是Se2Zn2降低了多种氨基酸含量及总氨基酸含量。具体而言，Se1Zn0显著提高了缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸3种必需氨基酸及精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸4种非必需氨基酸含量，同时显著降低了非必需氨基酸中的天门冬氨酸和组氨酸及必需氨基酸中的苏氨酸含量；Se1Zn1显著提高了非必需氨基酸中天门冬氨酸和酪氨酸及必需氨基酸中的苏氨酸和赖氨酸；Se1Zn2显著提高了非必需氨基酸中脯氨酸和蛋氨酸及必需氨基酸中苯丙氨酸和组氨酸含量，并降低胱氨酸含量；而Se2Zn2降低了8种氨基酸含量，其中必需氨基酸为蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸，非必需氨基酸为谷氨酸、甘氨酸和酪氨酸。

必需氨基酸中，Se1Zn1处理的苏氨酸达到最大值，为0.95 g·100 g-1，比对照Se0Zn0(0.82 g·100 g-1)提高了15.9%；Se1Zn0(0.74 g·100 g-1)和Se1Zn2(0.77 g·100 g-1)均显著低于对照，分别降低了9.8%和6.1%。对缬氨酸而言，Se1Zn0处理含量最高，Se1Zn2处理含量次之，另外，除Se2Zn2(0.97 g·100 g-1)与Se0Zn1(0.95 g·100 g-1)含量较低，与对照无显著差异外，其余所有处理均显著高于对照。Se1Zn2处理蛋氨酸含量(0.12 g·100 g-1)显著高于其余处理，而Se2Zn2处理蛋氨酸含量(0.05 g·100 g-1)显著低于其余处理，表明高硒处理会影响含硫氨基酸的合成。不同处理对异亮氨酸和亮氨酸的影响相似，总体表现为Se1Zn0>Se1Zn2>Se2Zn1>Se0Zn2>Se1Zn1>Se2Zn0>Se0Zn0。苯丙氨酸含量较高的处理依次为Se0Zn2(1.16 g·100 g-1)、Se1Zn2(1.16 g·100 g-1)、Se1Zn0(1.07 g·100 g-1)、Se1Zn1(1.06 g·100 g-1)，且均与对照差异显著，但Se0Zn2与Se1Zn2、Se1Zn0与Se1Zn1之间差异不显著，表明高锌或低硒均可提高苯丙氨酸含量。赖氨酸含量较高的处理依次为Se1Zn1(1.04 g·100 g-1)、Se1Zn2(0.96 g·100 g-1)及 Se0Zn2(0.94 g·100 g-1)，比对照Se0Zn0(0.83 g·100 g-1)分别提高了25.3%、15.7%及13.3%，含量低于对照并与之达到显著差异的处理为Se2Zn2(0.66 g·100 g-1)、Se2Zn0(0.77 g·100 g-1)、Se0Zn1(0.80 g·100 g-1)，降幅依次为20.5%、7.2%及3.6%。可见，低硒配施锌肥或单施高锌可显著提高赖氨酸含量，而高硒配施高锌大幅度降低赖氨酸含量，单施高硒或单施低锌也不利于赖氨酸含量的提高。

在非必需氨基酸中，仅有Se1Zn1处理的天门冬氨酸含量(3.40 g·100 g-1)显著高于对照Se0Zn0(3.36 g·100 g-1)，Se0Zn1处理含量与对照无差异，其余处理天门冬氨酸含量均显著低于对照，Se2Zn1(2.10 g·100 g-1)处理在显著降低天门冬氨酸含量(降幅为37.50%)的同时显著提高了谷氨酸含量(增幅为34.3%)，Se1Zn0降低了丝氨酸含量却显著提高了精氨酸和甘氨酸含量；对脯氨酸而言，Se1Zn2(1.47 g·100 g-1)与Se1Zn1(1.39 g·100 g-1)

显著提高了其含量，与对照相比，所有处理均显著提高了丙氨酸含量，Se1Zn0处理含量最高，除Se1Zn2处理胱氨酸含量与对照无显著差异外，其他处理都显著提高了胱氨酸含量，尤以Se2Zn0(0.08 g·100 g-1)含量最高；仅有Se1Zn2处理提高了组氨酸含量，其余处理均显著降低了组氨酸含量；对酪氨酸而言，Se1Zn1(0.50 g·100 g-1)、Se2Zn1(0.50 g·100 g-1)及Se1Zn0(0.47 g·100 g-1)处理显著提高了酪氨酸含量，而Se2Zn2(0.35 g·100 g-1)显著低于对照Se0Zn0(0.42 g·100 g-1)，其余处理变化不明显，与对照差异不显著。

此外，不同处理中含量较高的6种氨基酸的含量由高到低的排列次序基本相同，都是天门冬氨酸>谷氨酸>脯氨酸&亮氨酸>丙氨酸>甘氨酸；而含量较低的4种氨基酸基本上都是胱氨酸<蛋氨酸<酪氨酸<组氨酸，此结果与王照兰等[5]的研究结论基本一致。

2.3.3对必需氨基酸总量的影响 由表4可见，各处理必需氨基酸含量(E)变化范围为5.11～6.45 g·100 g-1，仍以Se2Zn2处理含量(5.11 g·100 g-1)最低，显著低于对照(5.29 g·100 g-1)；除Se0Zn1处理E与对照差异不显著外，其余各处理均显著提高E含量，E含量排在前4位的是：Se1Zn2(6.45 g·100 g-1)>Se1Zn0(6.35 g·100 g-1)>Se0Zn2(6.34 g·100 g-1)>Se1Zn1(6.26 g·100 g-1)，表明低硒高锌、单施低硒、单施高锌及低硒低锌显著提高紫花苜蓿必需氨基酸含量，从而显著提高苜蓿蛋白品质。

2.3.4对E/T和E/N值的影响 由表4可知，Se1Zn0、Se2Zn1、Se0Zn2、Se1Zn2处理的E/T值较高，分别为35.54%、35.19%、34.67%及34.50%，比对照Se0Zn0(32.25%)更接近40%，而E/N相应分别为55.13%、54.30%、53.08%和52.67%，与FAO/WHO[10]提出的E/T约为40%、E/N约为60%[17]相接近，而越接近FAO/WHO标准的产品的蛋白品质也越高。虽然Se1Zn2处理显著提高了苜蓿必需氨基酸含量，但由于相应处理下非必需氨基酸增加量较多，所以必需氨基酸在总氨基酸中所占的百分率有所降低，苜蓿的营养价值也随之下降。E/N指标变化规律与E/T指标变化规律相似，同样表现为Se1Zn0、Se2Zn1、Se0Zn2处理较高，Se2Zn2与Se0Zn1较低。结合E/T值和E/N值来看，Se1Zn0与Se0Zn2处理不仅提高了必需氨基酸的含量和比例，而且使E/T接近40%和E/N接近60%，使紫花苜蓿氨基酸的组成比例与FAO/WHO推荐的成人氨基酸模式基本符合，因此其营养价值较高。必需氨基酸总量百分比高于FAO/WHO模式(35%)的处理为Se1Zn0(35.54%)、Se2Zn1(35.19%)，与之相近的处理为Se0Zn2(34.67%)和Se1Zn2处理(34.50%)，其余处理均低于标准模式，且所有处理必需氨基酸总量百分比均低于鸡蛋模式(49.7%)。另外，紫花苜蓿蛋白质中4种呈味氨基酸天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量较高，占总氨基酸量的38.0%～43.8%，具有较好的适口性，尤以Se0Zn1处理口感最好。

综上所述，对氨基酸含量及组成影响最大的处理是Se1Zn0、Se1Zn1、Se1Zn2和Se2Zn2；对氨基酸总量影响最大的是：Se1Zn1、Se1Zn2、Se0Zn2、Se1Zn0；显著提高必需氨基酸总量的处理是：Se1Zn2、Se1Zn0、Se0Zn2、Se1Zn1；对E/T指标而言，Se1Zn0、Se2Zn1、Se0Zn2、Se1Zn2处理效果较为理想，E/N值来看，Se1Zn0与Se0Zn2处理不仅提高了必需氨基酸的含量和比例，而且使E/T接近40%和E/N接近60%，更符合FAO/WHO[10]推荐的成人氨基酸模式，其营养价值较高，而Se2Zn2处理效果最差。

2.4 不同处理对苜蓿营养价值及饲用价值的影响

紫花苜蓿蛋白的氨基酸评分和化学评分见表5。由表5可知，所有处理紫花苜蓿蛋白的第一限制氨基酸均为含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)，Se0Zn0、Se2Zn0和Se1Zn1处理紫花苜蓿第二限制氨基酸为异亮氨酸，其余6个处理的第二限制氨基酸为赖氨酸，但苯丙氨酸+酪氨酸、缬氨酸含量丰富，苏氨酸和亮氨酸含量也较丰富，因此，紫花苜蓿可作为优质的蛋白饲料与含硫氨基酸饲料合理搭配饲用。

从表6可知，除硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)和赖氨酸外，其余氨基酸的AAS均大于或接近100，说明紫花苜蓿中必需氨基酸含量是比较符合营养模式的。但各处理紫花苜蓿含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)的含量极低，可能与锌、硒的施用有关。依据表6还可见，从紫花苜蓿氨基酸化学评分(CS)来看，仍是含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)数值最低，其次是赖氨酸，CS较低的处理分别为Se1Zn0(84)、Se2Zn0(84)、Se2Zn1(87)、Se2Zn2(81)，对照(Se0Zn0)异亮氨酸的CS(88)也较低，其他氨基酸的CS都接近或高于100，说明除硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)及赖氨酸外，紫花苜蓿其他必需氨基酸与鸡蛋蛋白质相应必需氨基酸相比的营养价值较高，施硒除了影响含硫氨基酸的含量，也降低了赖氨酸含量。

表5 不同处理苜蓿蛋白和参比蛋白各必需氨基酸含量(mg·g-1粗蛋白) Table 5 Composition of essential amino acid in the alfalfa and the reference object (mg·g-1 crude protein)

表6 不同处理苜蓿蛋白氨基酸评分(AAS)和化学评分(CS) Table 6 Comparison of the amino acid score (AAS) and chemical score (CS) of alfalfa

饲养动物对饲料中氨基酸的需求与其自身的氨基酸组成显著相关，必需氨基酸指数(EAAI)反映了饲料蛋白源的必需氨基酸组成与饲养对象的必需氨基酸组成的拟合程度，因而可以更加准确、科学地评价饲料蛋白源的营养价值。由表7可知，各处理紫花苜蓿对牛肉的EAAI值为0.885～0.913，对兔肉为0.862～0.889，对山羊肉为0.891～0.919，因此，各处理紫花苜蓿对牛、兔及山羊均为良好蛋白源，不同处理间差异不显著。

3 讨论

3.1 硒、锌配施对紫花苜蓿干草产量及硒、锌吸收的影响

表7 不同处理必需氨基酸指数(EAAI)比较 Table 7 Comparison of the essential amino acid index

研究表明，施用硒肥不仅会影响作物对硒的吸收，并影响作物对其他矿质元素的吸收，影响作物的产量和品质。胡华锋等[18]研究表明，喷施硒肥能显著促进紫花苜蓿对锌和硒的吸收，并显著促进磷、铜、锰、硼、钴和钼的吸收，且对锌的吸收能力也与施硒量有关，当硒肥用量超过100 mg·kg-1时，紫花苜蓿对锌的吸收能力显著下降，表现为硒对锌的协同作用减弱。汤璐等[19]研究表明，硒的施入抑制了菊花(Chrysanthemummorifolium)对铜、锌元素的吸收，菊花花中的硒含量与硒的施入量之间存在显著正相关关系。杜倩等[20]研究也证实了硒锌交互效应与锌浓度有关，喷施锌(0.2%～0.4%)对各组分硒含量的提高效应明显，而高浓度锌(0.8%～1.2%)抑制了硒的吸收。但在微量元素如硒、锌含量及其有效性极低的石灰性潮土中关于锌、硒配施对紫花苜蓿产量及提高紫花苜蓿微量元素含量的报道较少。本研究供试土壤属于缺硒缺锌石灰性土壤，不仅含量较低，而且硒、锌有效态含量也较低，研究结果表明，通过基施速效态硒-锌微肥，可显著提高紫花苜蓿干草产量及锌、硒含量；单施硒或硒锌配施均极显著提高了苜蓿硒含量，硒锌间表现为协同作用；单施锌极显著提高了苜蓿锌含量，配施适量硒促进紫花苜蓿对锌的吸收，但过量施硒反而不利于苜蓿对锌的吸收，其具体机理需进一步研究。

3.2 硒、锌配施对紫花苜蓿氨基酸含量及组成的影响

牧草中氨基酸含量的高低、组成种类以及比例直接影响到牧草最终的品质以及家畜的生长及生产效率。前人主要针对不同牧草品种、牧草随季节或牧草不同生育期的氨基酸营养动态及氨基酸组成进行了研究[6-7]，姜健等[21]对苜蓿各部位氨基酸含量进行了测定，发现苜蓿茎和叶片中含有18种氨基酸，种子中含有17种氨基酸，同时发现不同苜蓿品种间、同一品种不同部位间氨基酸含量差异较大。刘龙等[22]以紫花苜蓿叶蛋白为原料，测定了其中的氨基酸组成，其主要为天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和赖氨酸。王照兰等[5]发现不同基因型紫花苜蓿氨基酸含量由高到低排列基本相同：为天门冬氨酸>谷氨酸>亮氨酸>脯氨酸；而含量最低的4种氨基酸基本上为胱氨酸<蛋氨酸<组氨酸<酪氨酸，本研究结果与此一致。综上可以看出，以往的研究均未涉及施肥对牧草氨基酸组成的影响。而且在实际生产中，仅用粗蛋白含量评价饲料的蛋白品质并不能说明该蛋白的“质”与“量”，因为蛋白质中氨基酸含量、组成及比例的不同导致其营养价值有较大差异，最终影响牧草品质及牲畜生产效率[23]。因此，本研究开展了硒、锌元素配施对紫花苜蓿氨基酸含量及组成的影响，研究结果表明，硒、锌元素配施各处理紫花苜蓿氨基酸总量以低硒低锌处理(Se1Zn1)含量最高，为18.89 g·100 g-1，以高硒高锌处理(Se2Zn2)含量最低，为15.88 g·100 g-1；必需氨基酸含量仍以Se2Zn2最低(5.11 g·100 g-1)，而以低硒高锌处理(Se1Zn2)最高(6.45 g·100 g-1)，研究结果可以更好地对改善紫花苜蓿氨基酸含量及提高品质提供有效途径。

3.3 硒、锌配施对紫花苜蓿氨基酸营养价值的影响

近年来，利用氨基酸的含量及均衡程度评价食品和饲料的营养价值比较广泛。刘青广等[24]利用模糊识别法和氨基酸比值系数法，对紫花苜蓿叶的蛋白营养价值进行了全面的评价，并与4种叶蛋白进行了比较，发现紫花苜蓿叶中蛋白质的氨基酸种类比较齐全，第一限制性氨基酸为赖氨酸，氨基酸比值系数分为78.52～85.76。张利平等[17]采用氨基酸评分及氨基酸指数法，对紫花苜蓿叶芽及其产品中氨基酸的营养进行了分析，结果表明色氨酸是紫花苜蓿芽的第一限制性氨基酸，其评分为56.7%，含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)为第二限制性氨基酸(评分低于100%)。

本研究以FAO/WHO评分模式和鸡蛋蛋白的必需氨基酸含量为标准，计算出各处理紫花苜蓿必需氨基酸的AAS值和CS值，结果发现，施硒明显降低了其AAS，其中含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)为第一限制性氨基酸，除硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)的CS很低外，施硒处理尤其是高硒处理Se1Zn0(84)、Se2Zn0(84)、Se2Zn1(87)、Se2Zn2(81)的CS均低于对照的CS(88)。何金环等[25]研究结果也发现聚合草(Symphytumpezegrinum)和紫花苜蓿的第一限制氨基酸均为含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)，AAS分别为47.5和30.0，本试验的结果与此一致，所不同的是本试验结果的AAS值更低(16～18)，这可能与不同的土壤条件及硒的施用方法和施用量有关。刘永红等[6]采用EAAI对阿拉善荒漠草地牧草氨基酸组成特点及营养价值进行了研究，结果表明内蒙古白绒山羊限制性氨基酸总含量为0.70%～3.22%；38种牧草的EAAI值，对羊肉为0.914～1.010，对山羊绒为0.976～1.250，对山羊毛为0.951～1.219。本研究也分别以牛肉、兔肉及山羊肉蛋白作为参比得到相似的结果，发现各处理紫花苜蓿对牛肉的EAAI值为0.885～0.913，对兔肉为0.862～0.889，对山羊肉为0.891～0.919，表明紫花苜蓿对3种动物来说均为优良的蛋白饲料。

4 结论

1)在严重缺硒和锌土壤中，硒、锌配施可显著提高紫花苜蓿干草产量及锌、硒含量；单施硒或硒锌配施均极显著提高了苜蓿硒含量，硒锌间表现为协同作用；单施锌极显著提高了苜蓿锌含量，配施适量硒促进紫花苜蓿对锌的吸收，但过量施硒反而不利于苜蓿对锌的吸收。

2)在低硒低锌的石灰性潮土上基施硒、锌微肥对紫花苜蓿的氨基酸组成及营养价值影响较大。紫花苜蓿总氨基酸含量及必需氨基酸含量变化范围分别为15.88～18.89 g·100 g-1与5.11～6.45 g·100 g-1，均以高硒高锌处理(Se2Zn2)含量最低，Se2Zn2处理降低了8种氨基酸含量，显著降低了紫花苜蓿蛋白品质。而Se1Zn0、Se1Zn1、Se1Zn2处理显著提高了紫花苜蓿必需氨基酸含量及必需氨基酸在总氨基酸中所占的百分率，表明在贫Se地区施一定浓度的硒肥，既可提高苜蓿产量，又可改善苜蓿品质，锌肥也有利于苜蓿营养价值的提高。

3)紫花苜蓿蛋白的第一限制氨基酸均为含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)，牧草对牛肉的EAAI值为0.885～0.913，对兔肉为0.862～0.889，对山羊肉为0.891～0.919，因此，紫花苜蓿对3种动物来说均为良好蛋白源。