利用流式细胞仪鉴定鸭茅倍性

许蕾，陈佩琳，冯光燕，钟旻依，景婷婷，黄琳凯，张新全

(四川农业大学动物科技学院， 四川 成都 611130)

鸭茅(Dactylisglomerata)是禾本科鸭茅属多年生优质牧草，种质资源丰富，自然界中存在二倍体(2n=14)、四倍体(2n=28)和六倍体(2n=42)3种类型[1]。鸭茅广泛分布于世界温带地区，截至目前，共包括四倍体及二倍体亚种20余种[2]。同源四倍体鸭茅在野生资源中占比最多，多作为引进及栽培使用，杂种优势较二倍体更明显；六倍体鸭茅种群数量较窄，在利比亚与埃及西部有一定的分布[3]；二倍体鸭茅对鸭茅的起源及进化研究有一定的参考价值[4]。鸭茅为异花授粉植株，野生资源存在天然杂交的现象，利用其天然材料进行杂交育种时存在一定的难度，通过对野生型鸭茅材料倍性的鉴定，能够为鸭茅遗传背景研究和种质资源利用建立依据，同时为远缘杂交及多倍体育种提供便利。

鸭茅染色体倍性与遗传多样性密切相关，其遗传多样性通过核型、生物学形态、生长发育指标、同工酶等方面共同表现[5-6]。早在1980年Falistocco等[7]发现位于意大利北、中、南部的18种野生鸭茅染色体数目为2n=4x=28，都为四倍体。20世纪以来，张新全等[8]和周自玮等[9]分别鉴定了11个野生鸭茅种质材料倍性，结果发现二倍体鸭茅‘皇木’、‘越西’、‘康定’、‘泥巴山’和‘茂县’、‘朗目山’、‘白水台’、‘德钦’染色体细胞数2n=2x=14，四倍体鸭茅‘庐山’、‘宝兴’、‘古蔺’染色体细胞数2n=4x=28，2007年Amirouche等[10]在阿尔及利比亚北部发现鸭茅二倍体居群12个，四倍体居群18个，由此可见，染色体计数法和染色体核型分析可以精确鉴定鸭茅倍性，但其操作耗时，不适宜大规模鉴定倍性。而通过形态、生理生化及分子水平探究鸭茅倍性时，其遗传多样性会受海拔、地域隔离、温度及月降水量的影响[11]。因此亟需找到一种快速有效检测鸭茅倍性的方法。

近年来，流式细胞仪检测已广泛应用于细胞学、分类学、遗传学、免疫学、发育生物学、细胞周期分析及植物基因组大小估算等研究中[12]。利用光学检测系统对高速流动的单细胞悬浮液进行多参数测量和信号处理得到的DNA含量分布曲线，可以直接观测植物倍性[13]。国内使用流式细胞术鉴定牧草细胞倍性的应用也愈加广泛，紫花苜蓿(Medicagosativa)、黑麦草(Loliumperenne)、蒙古冰草(Agropyronmongolicum)等已能够筛选出适宜的细胞核悬液和细胞核提取方法，通过选择一种参照材料作为外标，确定其荧光峰值范围，可以快速有效地确定植株倍性[14-16]。此外，内标法在植物倍性及细胞DNA含量检测中也较为常用，此过程将参照样与供试样混合后，通过DNA含量分布图得到的分析结果直观准确。本研究以外标法为主，内标法为辅，建立利用流式细胞仪鉴定鸭茅倍性的技术体系，并鉴定46份鸭茅种质资源的倍性，以期为鸭茅倍性育种工作提供基本信息。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1植物材料 鸭茅2006-1采自重庆巫溪，鸭茅90-103采自四川越西，均为野生种质材料。鸭茅供试样品共46个，由美国农业部植物种质资源库提供，种子来源于欧洲温带、西亚及北非等区域[17]。所有材料于四川农业大学成都校区草学基地(N 30°42′, E 103°51′)及雅安校区草学基地中(N 38°8′, E 103°14′)种植。试验于2017年3月开始。

1.1.2细胞解离液及染色液 OttoⅠ溶液：0.1 mol·L-1柠檬酸，0.5% (v/v) Tween 20，用0.22 mm无菌注射器过滤并储存于4 ℃冰箱中。OttoⅡ溶液：0.4 mol·L-1Na2HPO4·12H2O，用 0.22 mm无菌注射器过滤并避光常温(18～25 ℃)保存。OttoⅠ溶液与OttoⅡ溶液共同组成Otto解离液[18]。

LB01溶液[19]：15 mmol·L-1Tris，2 mmol·L-1Na2EDTA，0.5 mmol·L-1spermine·4HCl，80 mmol·L-1KCl，20 mmol·L-1NaCl，0.1 % (v/v) TritonX-100，用0.22 mm无菌注射器过滤并且储存在-20 ℃冰箱中。

Tris.MgCl2溶液[20]：200 mmol·L-1Tris，4 mmol·L-1MgCl2·6H2O，0.5 % (v/v)Triton X-100，配好后用0.22 mm无菌注射器过滤，储存于4 ℃冰箱中。

Hepes溶液[21]：10 mmol·L-1MgSO4·7H2O，50 mmol·L-1KCl，5 mmol·L-14-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES]，0.3 mmol·L-1二硫苏糖醇(1,4 dithiothreitol，DTT)，0.25% (v/v) TritonX-100，配好后用用0.22 mm无菌注射器过滤，现配现用。

PI 原液：配置1 mg·mL-1的原液后，过滤分装，锡纸包裹保存在-20 ℃冰箱。

RNase原液：配置1 mg·mL-1的 RNase的原液后，90 ℃热激15 min，用 0.22 mm无菌注射器过滤后分装，锡纸包裹保存在-20 ℃冰箱，使用时解冻并保存于4 ℃冰箱中。

1.1.3仪器 本试验使用OLYMPUS CX41生物显微镜(日本奥林巴斯公司生产)。流式细胞仪型号为Beckman Cyto FLEX(美国贝克曼库尔特有限公司生产)。

1.2 根尖压片鉴定

试验首先取鸭茅种子于光照培养箱中发芽，材料出芽后转至穴盘培养，待长至3～5 cm时移入大棚花盆中培养，选取分蘖较多、长势较好的单株材料置于光照培养箱内水培，剪下0.5～1.0 cm长的根尖部位置于EP管中，加水4 ℃冰箱储存(冰水浴)24 h后，转至卡诺氏固定液(无水乙醇：冰醋酸=3:1)中固定24 h，根尖固定后，用95%乙醇冲洗干净，再转入70%乙醇中储存。将固定好的根尖取出，冲洗干净后放入5 mol·L-1盐酸中处理5～10 min(或1 mol·L-1盐酸中60 ℃处理10～15 min)，当根尖呈现透明时取出，蒸馏水冲洗后，置于载玻片上并切取2 mm左右根尖生长点，盖上盖玻片轻轻按压敲打，在酒精灯上迅速烧片，然后用改良苯酚品红溶液染色5 min，压片完成后在OLYMPUS CX41生物显微镜下镜检，选取根尖有丝分裂中期染色体拍照。

1.3 花粉母细胞压片鉴定

取孕穗期鸭茅小穗，置于卡诺氏固定液24 h，用95%乙醇洗净后转入70%乙醇中，于4 ℃冰箱储存[22]。从固定好的小穗上取下小花，使用镊子及解剖针剥离下雄蕊置于载玻片上，用改良苯酚品红溶液染色5 min，轻轻用解剖针切至花粉母细胞离出，盖上盖破片轻按后酒精迅速烧片，镜检观察减数分裂中期染色体配对情况。

1.4 鸭茅细胞核悬液制备

本试验选用Otto、LB01、Tris.MgCl2、Hepes解离液进行对比试验，目的是筛选出适合鸭茅细胞核分离的最佳解离液，从而得到鸭茅细胞核。具体操作为：先将干净培养皿倾斜置于冰盒上，取供试样品幼嫩叶片约20 mg，蒸馏水冲洗表面后用滤纸吸干水分，加入1 mL预冷的解离液并没过材料，用锋利的刀片将叶片切碎，吸打混合后，吸取上清，通过300～400目(0.04～0.05 mm)尼龙网将液体移入1.5 mL EP管中，1100 r·min-1离心5 min，收集细胞核，弃上清至细胞核上方有100 mL左右液体，轻轻摇动重悬浮细胞核，再加入相同的解离液重悬即可。然后加入PI原液50 μg·mL-1，RNase原液50 μg·mL-1，4 ℃黑暗条件染色20～40 min，振荡器摇晃后继续用300～400目(0.04～0.05 mm)尼龙网过滤，置于流式细胞仪上检测。

对于Otto核悬液的制备，本试验参照Dolezel等[18]的两步法进行细胞核悬浮液的制备和染色。需要先加入1 mL预冷的OttoⅠ解离核细胞，离心后用100 μL冰冻的OttoⅠ溶液重悬，再加入OttoⅡ溶液1 mL。

1.5 鸡血红细胞提取

试验利用家鸡鸡血红细胞作为参照估测鸭茅细胞核DNA含量大小。家鸡鸡血细胞提取步骤为：10 μL鸡血加入1 mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)稀释，再加入1 mL浓度为0.2%的曲拉通，4 ℃放置10 min后取出，1000 r·min-1离心5 min，去上清，4 ℃条件下加PI染色30 min，PBS重悬，1000 r·min-1再次离心5 min，去上清后用PBS重悬即可。使用同一种参照材料检测细胞核DNA含量大小时，注意控制仪器电压保持不变。

1.6 外标法测定鸭茅倍性

流式细胞仪外标法测定倍性时，需要先检测一个独立的参照样品再进行供试样品检测，每个待测样品设置3次重复，每次收集细胞数不少于10000个，检测后通过公式换算出供试样品的倍性及DNA含量。本试验首先选取鸡血红细胞[1.25 pg(1222.5 Mb)[23]]为外标参照物，上机检测后使用MoFit软件进行绘图与结果分析，利用样品G1期荧光强度均值计算鸭茅2006-1的DNA含量。

同时选取二倍体材料2006-1作为外标参照物，利用流式细胞仪光电倍增管接受鸭茅细胞核悬液的荧光信号与散射光信号，将其转化为电信号后传入计算机中，通过CytExpert软件创建图形和门控，调整阈值，在仪器采样后最终得到鸭茅叶片荧光直方图(峰图)，其横坐标表示样品G1峰的荧光位置，即2C荧光通道范围，纵坐标表示样品细胞核数目。保持流式细胞仪参数不变，以2006-1的G1峰荧光均值为参照标准确定供试样品倍性水平。其倍性及DNA含量计算公式如下：

供试样品倍性水平或供试样细胞核DNA含量=(参照样品倍性水平或参照样细胞核DNA含量×供试样品G1峰荧光均值)/对照样品G1峰荧光均值

1.7 内标法测定鸭茅倍性

与外标法不同的是，流式细胞仪内标法测定鸭茅倍性时，需要将已知倍性的参照样品2006-1和供试样品等量混合，然后通过检测确定主峰荧光通道范围，得出供试样品的倍性水平，每个待测样品设置3次重复，每次收集细胞数不少于10000个。值得注意的是，若参照植物和供试样品的峰完全重叠表明两者倍性相同。若出现内标参照样品和供试样品两个独立的峰，则表明供试样倍性可能与参照样存在差异，我们选取其中的主峰为依据分析倍性即可。

1.8 细胞核DNA含量变异分析

样品G1期峰荧光均值与细胞核DNA含量线性相关，其变异系数(coefficient of variation,CV)值能够有效表现流式细胞仪检测数据的准确程度。试验经Cyto FLEX流式细胞仪检测得到每个样品的直方图及散点图后，以FSC格式导出，打开ModFit软件进行数据拟合，除能得到样品峰荧光均值外，还能得到G1期的变异系数CV。CV值越小，数值越稳定，代表样品检测变异程度越小[24]。

2 结果与分析

图1 压片法测定鸭茅细胞倍性Fig.1 Ploidy analysis with chromosome compression A: 2006-1花粉母细胞减数分裂中期I染色体, 示7II; B: 90-103根尖染色体, 2n=14. A: Mitosis of PMC in 2006-1, showing 7II in metaphase Ⅰ; B: Mitosis of root tip squashing in 90-103, showing 2n=14.

2.1 鸭茅倍性的细胞学鉴定

鸭茅花药压片后，通过显微镜观察2006-1花粉母细胞减数分裂中期染色体数目发现，鸭茅14条染色体配对形成7对，染色体形态为棒形、环形(图1A)，这与之前本课题组鸭茅花粉母细胞染色体形态一致[25]。

同时我们也采用90-103鸭茅作为参照进一步验证了二倍体鸭茅染色体数目，鸭茅根尖压片后，通过显微镜观察其细胞有丝分裂中期染色体数目2n=2x=14(图1B)。

2.2 解离液选择影响细胞核提取效果

在控制处理一致的条件下，分别使用Otto、LB01、Tris.MgCl2、Hepes解离鸭茅叶片，每个处理3个重复，由流式细胞仪检测结果得出，Tris.MgCl2、Hepes处理下的鸭茅叶片都无法产生完整的样品峰，叶片细胞核DNA含量很少，碎片峰面积高于样品峰面积(图2b，c)。而运用Otto、LB01解离都能够得到完整的样本峰，根据本试验细胞核提取条件得出，Otto解离出的样本峰优于LB01，其峰更为集中，重复性好(图4a和图2a)。同时，使用ModFit软件测定不同解离液条件下G1期CV值发现，使用Otto提取鸭茅细胞核时CV值为3.84%～5.08%，使用LB01时CV值为9.68%～15.82%，其余解离液检测的CV值都大于10%或CV值无法计算得出，这表明利用Otto解离液提取细胞核结果最为准确，可得明显主峰。

图2 不同解离液对鸭茅2006-1出峰效果影响Fig.2 Effect of different lysis buffer on 2006-1 peak values a: LB01; b: Tris.MgCl2; c: Hepe

2.3 利用外标法分析鸭茅倍性

试验以鸡血红细胞为参照样品，分别进行鸡血红细胞和鸭茅2006-1细胞核DNA含量与荧光强度的检测，分析得到鸭茅2006-1的DNA含量为2275.79 Mb(图3)。以二倍体鸭茅2006-1为参照样品，分别进行样品倍性的检测，使用参照材料对仪器进行校准后，再依次对其他鸭茅供试材料进行检测，结果发现PI237609、PI295271为二倍体，宝兴、PI538922、PI310393为四倍体(图4)。

图3 以鸡血为外标检测鸭茅DNA含量Fig.3 Detection of DNA content with chicken blood as external standard a: 鸡血红细胞 Red blood cells of chicken blood; b: 2006-1-1; c: 2006-1-2; d: 2006-1-3; e: 2006-1-4. mean: 荧光均值； CV： 变异系数The coefficient of variation.

图4 流式细胞仪外标法测定细胞倍性Fig.4 Ploidy analysis with external standard a: 2006-1; b: PI237609; c: PI295271; d: 宝兴 Baoxing; e: PI538922; f: PI310393.

2.4 利用内标法分析鸭茅倍性

与外标法相比，内标法每次处理供试样品时，需要加入等量的2006-1叶片一同切碎。结果发现若图形内只存在单峰且其荧光均值在2006-1荧光值范围内，峰值高、峰面积大，此时只存在核DNA含量为2C的细胞，鉴定供试样品为二倍体；若图内出现双峰，由于混入参照样品2006-1为二倍体，除存在核DNA含量为2C的细胞，同时还有核DNA含量为4C的细胞，其荧光值为二倍体的2倍，鉴定供试样品为四倍体。由此，得出宝兴为四倍体，PI237609、PI295271、PI224599、PI230116、PI265568为二倍体(图5)。

图5 流式细胞仪内标法测定细胞倍性Fig.5 Ploidy analysis with internal standard a: 宝兴 Baoxing; b: PI237609; c: PI295271; d: PI224599; e: PI230116; f: PI265568

2.5 内标法和外标法的比较分析

试验表明，以鸭茅2006-1作为内标参照物，通过ModFit软件分析得出，5个二倍体材料的荧光均值为(56.45±6.96)，变异系数(CV值)于5%上下波动，此时测得的荧光均值(mean值)更稳定，检测数据准确性更高(表1)。外标法检测对仪器电压及人为操作有一定的要求，一般情况下可以得到较为准确的结果，有时检测结果会优于选择内标参照物的检测(图6b，e)，但其存在的偶然误差会影响出峰横坐标大小，即引起荧光通量范围的改变。偶然误差影响较大时，仪器将无法测出完整样品峰，只能显示碎片峰，出现CV值数值偏大和检测不出的情况，因此无法准确判断材料倍性(图6f )，此时使用重复试验或者内标法检测，可以重新获得检测者所需的结果，但当材料珍贵缺少时，选择内标法更为直观和准确，且检测结果不易受其他组峰的干扰。

当供试样品与参照样品倍性产生明显差异时，外标法检测可以直观体现材料倍性。本试验在检测宝兴倍性时发现，使用外标2006-1为参照时，只存在单峰，此时检测宝兴的mean值为136.44，为二倍体2006-1的2倍，CV值为6.43%；当使用2006-1为内标参照物时，宝兴峰面积占全部峰面积的24.03%，其mean值为126.44，CV值为5.37%，由此可见，虽然内标法CV值更小，检测更为精确，但外标法对于倍性的直观检测具有一定优势。因此，本试验在使用外标法鉴定46种材料倍性后，综合数据针对其中21种材料继续进行内标分析，共鉴定出二倍体材料22份，四倍体材料24份(表2)。

表1 鸭茅二倍体内外标荧光均值和变异系数比较 Table 1 Comparison of external and internal standard on diploid materials with mean and CV

图6 利用ModFit的内外标比较Fig.6 Comparison of external and internal standard with ModFit graph 内标 Internal standard: a: 宝兴 Baoxing; b: PI295271; c: PI231517; 外标 External standard: d: 宝兴 Baoxing; e: PI295271; f: PI231517.

序号No.种质编号Accession No.亚种D. glomeratasubsp.倍性Ploidy level 原产地Seed source序号No.种质编号Accession No.亚种D. glomeratasubsp.倍性Ploidy level原产地Seed source1AKZ-NrGR667aschersoniana2x波兰Polen24PI306730hispanica4x德国Greece2AKZ-NrGR668aschersoniana2x波兰Polen25PI310393woronowii4x苏联Soviet Union3PI170344hispanica2x土耳其Turkey26PI346967marina4x葡萄牙Portugal4PI224599hispanica2x以色列Israel27PI346968marina4x葡萄牙Portugal5PI229472marina4x阿尔及利亚Algeria28PI346969marina4x葡萄牙Portugal6PI230116hispanica2x伊朗Iran29PI368880santai2x阿尔及利亚Algeria7PI231517hispanica2x摩洛哥Morocco30PI372621lobata4x德国Germany8PI237601juncinella2x西班牙Spain31PI418678juncinella4x西班牙Spain9PI237602lusitanica2x葡萄牙Portugal32PI441032smithii4x英国United Kingdom10PI237603lusitanica2x葡萄牙Portugal33PI441034smithii4x英国United Kingdom11PI237604marina4x葡萄牙Portugal34PI477989marina4x法国France12PI237605santai4x阿尔及利亚Algeria35PI499583glomerata2x中国China13PI237607smithii2x西班牙Spain36PI535737hispanica2x利比亚Libya14PI237609ibizensis2x西班牙Spain37PI538891glomerata2x俄罗斯Russian Federation15PI237610woronowii4x伊朗Iran38PI538920glomerata4x俄罗斯Russian Federation16PI251815glomerata4x意大利Italy39PI538921lobata4x俄罗斯Russian Federation17PI253572hispanica4x葡萄牙Portugal40PI538922woronowii4x俄罗斯Russian Federation18PI265567hispanica4x法国France41PI577065marina4x葡萄牙Portugal19PI265568hispanica2x西班牙Spain42PI577066marina4x葡萄牙Portugal20PI283241lobata2x德国Germany43PI634265lusitanica2x西班牙Spain21PI283242lobata4x德国Germany44ABY-BC-4800-1980Ujudaica2x黎巴嫩Lebanon22PI283243woronowii4x苏联Soviet Union45ABY-BC-5368-1970Uparthiana2x伊朗Iran23PI295271himalayensis2x印度India46w41628glomerata2x俄罗斯Russian Federation

3 讨论

通过形态学鉴定植株倍性，是早期研究者最常使用的方法。1994年Loticato等发现二倍体与四倍体鸭茅叶片长度及株丛大小存在差异，在开花期形态差异最显著，此时四倍体植株较二倍体植株更低矮，花序更直立，但仅通过形态学观察不能精准判断鸭茅倍性，种质隔离及环境因素等作用，都有可能使杂交后代出现杂合，甚至是变异的情况。而在幼苗期，不同倍性材料形态学差异更不显著，利用流式能在幼苗期鉴定植株倍性，将为高效准确筛选杂交育种材料提供便利。染色体计数和细胞学观察，是分析植物倍性最直接有效的方式，但其工作量较大，根尖的获取，细胞分裂时期的控制等多种因素影响其观察的效果。相比较而言，利用花粉压片要比根尖压片更为准确，但鸭茅花粉育性与结实率都不高，花粉数目差异较大[27]，二倍体鸭茅花粉数量更少，操作更具难度。本试验结合了前人对鸭茅的核型分析，主要采用染色体计数的方法鉴定鸭茅2006-1的倍性，然后在此基础上进行流式细胞仪分析，能够同时检测多种鸭茅材料的倍性，此方法取材时间集中，取样量少，细胞易提取，检测速度快。

内标与外标检测是流式细胞仪用来确定植物DNA含量和植物倍性的常用方法，相比较而言，内标法可以通过等量混合参照样品和供试样品获取样品峰差异，其鉴定结果准确，受仪器电压及人为操作影响变异较小，检测相同物种材料时，若出现参照主峰与供试样主峰重叠且只有唯一峰时，说明两者倍性相同，若出现双峰且两峰DNA含量接近时，则为不同倍性材料，只有当两者DNA含量相近且无法区分差异时，倍性鉴定就会存在困难。外标法较内标法操作简单，对于同一物种相同条件下倍性的大量检测具有优势，一般情况CV值保持在5%左右，但同时，外标法也要严格控制仪器条件与材料处理条件一致，减少人为操作产生的误差，对于检测效果较差，CV值过大的情况，可以多次重复排除人为与仪器产生的误差。同时，内外标参照物的选择，一定程度会影响检测样品DNA含量。有研究表明参照样本选择同属及近缘种材料，DNA含量相近，测试的差异性较小，更有易于准确表达待测样品的倍性[28]。但又有试验发现，即使是植物细胞，某些条件下也可以选用动物细胞作为参照，例如使用人类口腔上皮细胞做参照[29]，可用于测定棉花(Gossypiumspp.)胚珠内DNA含量；用鸡血红细胞做植物的参照检测倍性，于苹果(Malusdomestica)[30]、桃属(Amygdalus)、李属(Prunus)[31]及猕猴桃(Actinidiaspp.)[32]中都有较好效果，这可能是由于选用的动物细胞核DNA与供试样品核DNA含量差异较小导致的。此外，试验也估测了鸭茅2006-1的细胞核DNA含量，起初选用大麦(Hordeumvulgare)为参照，估测得到的结果差异较大，此差异的产生可能与大麦基因组较大有关(5.1 Gb[33])，故后续选取鸡血为参照，可较为精确地估测2006-1的倍性，在此基础上，以2006-1为参照检测其他鸭茅材料倍性也更为准确。

流式细胞仪分析植物细胞倍性时的关键一步就是解离液的选择，对比发现，使用Tris.MgCl2、Hepes处理鸭茅叶片时无法产生样品峰，而在既含酸又含Na盐的Otto、LB01解离液中能够测得较高的核DNA含量，虽然Dpooležel等[34]和柳青慕等[35]使用LB01解离液可以得到较好的提取效果，但其中的添加物β-巯基乙醇毒性较大，本试验尝试使用去除β-巯基乙醇的LB01解离液提取鸭茅细胞核DNA发现，检测样能够产生明显的峰，但碎片峰所占面积较大，严重干扰鉴定结果准确性，因此最终选用Otto提取鸭茅细胞核，其出峰效果好，对于细胞核较少的样品也能得到完整的峰。DTT等物质有利于消除叶片中的酚类粘连物质，但对于鸭茅细胞核的提取有抑制作用。关于探究离心时间、离心次数、PI含量、染色时间及过滤次数等多种因素对流式结果的影响，我们对比细胞核解离3 min与解离5 min，离心5 min与离心10 min，离心1次与离心2次得出，解离时间和离心时间的延长，会增加碎片峰产生的概率，解离次数的增加虽然会改变检测准确度，但在控制解离时间的前提下，检测样品出峰效果并没有较大的差异。上机前的再过滤更有利于出峰，防止堵塞仪器。此外，成熟叶片较幼嫩时期的叶片更易产生杂峰，为防止主峰分析受到干扰，尽量选择幼嫩叶片检测，或者使用F1代种子培养的植株叶片来检测。

4 结论

本研究采用流式细胞术，以鸭茅二倍体材料2006-1为参照，筛选常用的4种细胞核DNA解离液，通过外标法为主，内标法为辅的检测方法，建立一套能够高效稳定检测鸭茅倍性的流式检测技术。通过此技术成功鉴定出46种鸭茅种质材料倍性。通过DNA含量分布图和ModFit数据分析得出，相对于LB01、Tris.MgCl2和Hepes，Otto是最适合鸭茅叶片的解离液，产生的样品峰清晰集中，检测数据变异小，准确性好。在检测方法的选择上，内外标法各有优劣势，对比5种二倍体和1种四倍体材料发现，内标法检测相同倍性材料的荧光均值较稳定，且针对单个样品的检测准确性较高；外标法检测可能存在偶然误差，表现为不能正常出峰或CV值过大，但外标法操作便捷，数据直观性很好，适于大量检测。