空气细颗粒物PM2.5水溶成分对人黑素细胞系PIG1增殖、迁移和黑素合成的影响

索丹凤 曾三武 孟令贺 张峻岭天津市第一中心医院皮肤科 3009；天津市中医药研究院附属医院皮肤科 3000

空气细颗粒物（particulate matter，PM）污染可危害人体健康。作为雾霾重要组成部分的PM2.5可诱发或加重人体多个系统疾病［1］。国内外大量流行病学调查显示，颗粒物浓度的上升与疾病的发病率、死亡率关系密切，尤其是呼吸系统及心血管系统疾病［2-4］。皮肤作为人体最大的器官，直接暴露于空气污染物中，时刻受到污染物的威胁［5］。黑素细胞作为表皮的重要组成成分，在生长、分化、增殖、迁移、凋亡、黑素合成等过程中某一个或几个环节出现异常，将导致黑素形成和沉着异常，发生色素障碍性疾病。迄今未见有关PM对黑素细胞影响的报道。本研究旨在探讨PM2.5对人黑素细胞系PIG1增殖、迁移、酪氨酸酶活性及黑素含量等生物学特性的影响，进而为PM2.5在皮肤病学领域的相关研究奠定基础。

一、材料与方法

（一）材料：黑素细胞系PIG1、细胞培养液（上海Sciencell公司），0.25%胰酶、4%多聚甲醛溶液（上海索莱宝生物科技公司），DMEM培养液（美国Hyclone公司），NaOH（国药集团化学试剂北京有限公司），TritonX-100［生工生物工程（上海）有限公司］，Transwell小室（美国Corning公司），结晶紫染液（上海碧云天生物公司）。噻唑蓝（MTT）试剂盒、左旋多巴（L-DOPA）、牛血清白蛋白（BSA）及二甲基亚砜（DMSO）均来自美国Sigma公司。

（二）方法：

1.PM2.5的采集及制备［6］：选取天津市汽车流量大、污染较重的地区为采样点。采用JCH-120F-02型智能颗粒物采样器（青岛聚创环保科技有限公司）收集采暖季雾霾天气PM2.5于专用质量分析纤维滤纸上，将载有颗粒物的滤纸剪成1 cm×1 cm小块浸于三蒸水中，4℃环境下超声振荡30 min，共4次，洗脱颗粒物，振荡液经6层纱布过滤，将滤液置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥成干粉，-20℃保存备用。临用前称取一定量PM2.5干粉，在超净台中加入DMEM培养液超声振荡15 min混匀并灭菌，配制成终质量浓度为 0、10、20、50、100、200 mg/L 的混悬液备用。由于PM2.5为混合物，其水溶成分可以溶于培养基内，而脂溶成分不溶解，因此本研究探讨其水溶成分对黑素细胞的影响。

2.细胞培养：人黑素细胞系PIG1培养于含10%胎牛血清的254培养基中，在5%CO2、37℃培养箱中培养、传代，选择对数生长期细胞进行实验。

3.MTT法检测细胞增殖：消化、计数PIG1细胞，配制成5×104个/ml的细胞悬液，向96孔细胞培养板中每孔加入0.1 ml细胞悬液，置于5%CO2、37℃培养箱中培养过夜。将PIG1细胞分为实验组和对照组，实验组分别用0.1 ml 10、20、50、100、200 mg/L PM2.5 工作液处理，对照组不加PM2.5，其他处理同实验组，置于5%CO2、37℃培养箱中培养48 h。弃上清液，PBS洗涤2次后，每孔加入100 μl MTT溶液（1 g/L），在培养箱继续培养4 h；弃上清液，每孔加入150 μl DMSO溶解，轻轻混匀10 min，置酶标仪570 nm处读取各孔吸光度（A值），计算细胞增殖率。细胞增殖率（%）=实验组A值/对照组A值×100%。每个浓度设3个复孔，取平均值。

4.微孔膜法检测细胞迁移：按照上述方法调整PIG1细胞至5 × 104个/ml。取200 μl细胞悬液加入Transwell上室，下室加入500 μl 10 mg/L PM2.5工作液（预实验显示该浓度PM2.5对黑素细胞增殖无抑制或促进作用），在培养箱中孵育48 h后，取出Transwell上室，弃去孔中培养液，擦掉上层未穿过膜的细胞。用PBS洗2遍，4%多聚甲醛溶液4℃固定15 min；0.1%结晶紫染色20 min，用PBS洗3遍，自然干燥。每孔加0.1 ml 33%（质量浓度）醋酸脱色，充分振荡后用酶标仪测定570 nm处A值以间接反映细胞数量。设3个复孔，取平均值。迁移率（%）=迁移细胞A值/迁移前细胞A值×100%。

5.多巴氧化法检测酪氨酸酶活性：调整PIG1细胞至2×105个/ml，6孔细胞培养板中每孔加入2 ml细胞悬液后置于5%CO2、37℃培养箱中培养过夜。PIG1细胞亦分为对照组和5个实验组，向实验组每孔加入2 ml PM2.5工作液，使其终浓度分别为10、20、50、100、200 mg/L，对照组加入不含PM2.5的工作液2 ml，置于5%CO2、37℃培养箱中培养48 h。弃上清液，PBS洗涤2次，每孔加入1%Triton X-100溶液，迅速放入-80℃冰箱内30 min，室温融化，重复3次使细胞完全破裂。37℃预温后加入10 g/L左旋多巴溶液，37℃孵育30 min，置酶标仪490 nm处测定A值（表示酪氨酸酶活性）。每个浓度设4个复孔，取平均值。

6.NaOH裂解法检测黑素含量：按上述多巴氧化法检测酪氨酸酶活性方法对PIG1细胞进行分组处理，置于5%CO2、37℃培养箱中培养48 h后，弃上清液，PBS洗涤2次后使用0.25%胰酶消化、PBS洗涤并离心得到沉淀。加入含10%DMSO的NaOH溶液0.5 ml，充分振荡，于80℃水浴中封口静置30 min。用酶标仪在470 nm处测定A值（表示黑素含量）。每个浓度设4个复孔，取平均值。

7.统计学处理：应用SPSS17.0统计软件包进行分析。计量资料用±s表示，两个样本均数间比较采用t检验，多个样本均数间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK法，相关性分析采用线性相关分析方法。

二、结果

1.不同浓度PM2.5对人黑素细胞PIG1增殖的影响：各组间PIG1细胞增殖率（表1）差异有统计学意义（F=121.90，P＜0.01），10 mg/L PM2.5组与对照组比较，差异无统计学意义（q=2.13，P＞0.05），20、50、100、200 mg/L PM2.5组与对照组相比，差异均有统计学意义（q值分别为6.30、11.17、19.36、28.84，均P＜0.05），且随着PM2.5浓度（20 ～200 mg/L）升高，细胞增殖率逐渐降低（r=-0.98，P＜0.01）。

2.PM2.5对人黑素细胞PIG1迁移的影响：见图1。10 mg/L PM2.5组细胞迁移率为（66.23±1.11）%，对照组为（76.86±1.81）%，两组间差异有统计学意义（t=7.55，P＜0.01）。

3.不同浓度PM2.5对人黑素细胞PIG1酪氨酸酶活性的影响：见表1。各组PIG1细胞酪氨酸酶活性差异有统计学意义（F=283.64，P＜0.01），10 mg/L PM2.5组与对照组相比，差异无统计学意义（q=0.22，P＞0.05）；20、50、100、200 mg/L组与对照组相比，差异有统计学意义（q值分别为10.74、22.42、31.92、40.66，均P＜0.01），各组间差异亦有统计学意义（均P＜0.01），且随着PM2.5浓度（20～200 mg/L）升高，酪氨酸酶活性逐渐降低（r=-0.93，P＜0.01）。

4.不同浓度PM2.5对人黑素细胞PIG1黑素含量的影响：见表1。各组PIG1细胞黑素含量差异有统计学意义（F=123.00，P＜0.01）。10、20 mg/L PM2.5组与对照组相比，差异无统计学意义（q值分别为2.16、2.98，均P＞0.05）；50、100、200 mg/L PM2.5组与对照组相比较，差异均有统计学意义（q值分别为13.37、22.64、25.50，均P＜0.01）；50 mg/L PM2.5组与100、200 mg/L PM2.5组相比，差异均有统计学意义（q值分别为9.27、12.13，均P＜0.01）；100与200 mg/L PM2.5组间差异无统计学意义（q=2.85，P＞0.05）。相关性分析显示，随着PM2.5浓度（50～200 mg/L）升高，黑素含量下降（r=-0.97，P＜0.01）。

图1 微孔膜法检测PM2.5对人黑素细胞PIG1迁移的影响（×200） 1A：对照组；1B：10 mg/L PM2.5组

表1 不同浓度PM2.5对人黑素细胞PIG1增殖率、酪氨酸酶活性和黑素含量的影响（±s）

表1 不同浓度PM2.5对人黑素细胞PIG1增殖率、酪氨酸酶活性和黑素含量的影响（±s）

注：n=4。a与对照组相比，P＜0.01

PM2.5浓度0（对照组）10 mg/L 20 mg/L 50 mg/L 100 mg/L 200 mg/L细胞增殖率（%）100.00±1.41 97.77±0.88 93.41±2.13a 88.31±1.36a 79.75±1.89a 69.83±2.50a酪氨酸酶活性（A490值）0.307±0.006 0.306±0.005 0.268±0.009a 0.225±0.011a 0.191±0.005a 0.159±0.006a黑素含量（A470值）0.217±0.005 0.212±0.005 0.210±0.006 0.183±0.006a 0.159±0.004a 0.151±0.005a

三、讨论

以往研究表明，PM2.5可抑制角质形成细胞增殖，促进其凋亡［7］，且PM2.5能够诱导HaCaT细胞发生氧化应激反应［8］。黑素细胞是表皮中另一重要组成成分，而有关PM2.5对其的影响暂未见文献报道。本研究显示，20、50、100、200 mg/L PM2.5对PIG1细胞增殖及酪氨酸酶活性均具有明显抑制作用，且浓度越高，抑制作用越明显；50、100、200 mg/L PM2.5可降低黑素细胞的黑素含量；10 mg/L PM2.5可抑制黑素细胞迁移。以上结果表明，PM2.5对黑素细胞增殖、迁移、酪氨酸酶活性、黑素合成均有抑制作用，可造成毒性损伤。由于PM2.5成分复杂，其表面可吸附大量有毒有害物质如重金属、酸性氧化物、有机污染物、细菌和病毒等，究竟是哪一种或几种组分引起黑素细胞毒性损伤及损伤机制，均待进一步研究。此外，PM2.5的生物学毒性作用可能是非特异性的，在后续的研究中我们拟以角质形成细胞做为平行对照，并建立二者共培养体系，以阐释PM2.5是否存在黑素细胞的专一毒性效应及其效应机制。

综上，本研究为PM2.5在皮肤病学领域尤其是色素性疾病的相关研究奠定了一定的基础。但由于本研究仅在体外环境下评价了PM2.5对培养的人黑素细胞系PIG1的影响，存在一定的局限性，将来还需在体内环境下进行更加深入的研究。