青蒿琥酯对鸡胚和雏鸡的毒性作用研究

宋炎博,王捍东

(1．扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225009； 2. 江苏省动物重要疫病与人畜共患病防控协同中心，江苏 扬州 225009)

青蒿琥酯(Artesunate，AS)，化学名为二氢青蒿素-1,2-α-琥珀酸单酯，是具有倍半萜结构的抗疟药青蒿素的衍生物[1]，临床上用于抢救和治疗脑型疟疾和恶性疟疾。青蒿琥酯对刚地弓形虫和其他致病顶复门原虫具有良好的杀灭作用，只需要几微摩尔用量就能有效杀灭弓形虫[2]。近年研究发现，青蒿琥酯除了具有良好的抗疟疾效果，还有显著的抑制肿瘤细胞作用，且不易产生耐药性[3]。此外，青蒿琥酯还具有抗真菌、细菌[4]、病毒[5,6]等效果。青蒿琥酯具有良好的生物学活性，同时也具有一定的毒副作用。White TE等通过实验证明青蒿琥酯具有明显的胚胎毒性[7]。本研究通过对鸡胚注射和雏鸡口服不同剂量的青蒿琥酯，探讨青蒿琥酯急性毒性以及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要药物及试验器材

青蒿琥酯(桂林南药股份有限公司，批号：H10930195)；溶剂(碳酸氢钠注射液)为澄明，无色液体；溶剂(氯化钠注射液)为澄明，无色液体；1mL无菌一次性注射器(江苏长城医疗器械有限公司，批号：20150401，产品标准号：YZB/国1794-2011)；打孔器；针筒式滤膜细菌过滤器(岛津技术上海商贸有限公司，批次：130922052，孔径：0.22μm)；碘酊；酒精棉球；中性福尔马林溶液；万盛微电脑全自动汉显孵化机(南京万盛孵化设备有限公司，型号：WSC-4型，325枚)；生物安全柜(苏州净化，SW-CJ-2F双人双面)。

1.2 试验动物

海兰白种蛋购自江苏省仪征市大巷永康种鸡场，9日龄。

雏鸡：由江苏省仪征市大巷永康种鸡场购回的海兰白种蛋经本实验室自行孵化出来(孵化过程参照上海市动物疫病预防控制中心起草的标准：DB31/T305-2014)。

1.3 试验方法

1.3.1青蒿琥酯对鸡胚急性毒性预试验

1.3.2青蒿琥酯对鸡胚急性毒性正式试验

种蛋从贮藏室拿出后,在孵化箱内恒温38℃，60%湿度下平衡4～12h。在注射前，先用碘酊涂擦气室，然后用75%的酒精涂擦气室脱碘。在靠近气室1.5cm处的蛋壳上开一小孔。试验前通过反复毒理预实验筛选出100%致死剂量和0%致死剂量，最终得出最大致死剂量为125μg，最小致死剂量为50μg，因此设四个剂量梯度：125μg，100μg，75μg，50μg。然后，将不同剂量的青蒿琥酯注射到鸡胚尿囊腔0.1mL，置于38℃孵化箱内，每天照鸡胚一次，观察存活情况，将死胚拣出，计算死亡率。实验重复三次。用简化寇氏法计算半数致死量。LD50计算公式[8]: LD50= lg-1[ Xm-i(P-0.5)],式中, Xm为最大剂量的对数值, P 为各剂量组死亡率, i 为相邻对数剂量之差。

1.3.3雏鸡毒性研究

选取体重相近的3日龄雏鸡，分组，每组6只，设3个剂量梯度：40mg/kg，20mg/kg，10mg/kg，空白对照组不作任何处理。通过口服一次给药, 给药后观察4d，记录各组雏鸡的体重变化情况。剖杀各组雏鸡，取肝脏放入中性福尔马林固定，HE染色，镜下观察组织结构。

2 结果

2.1 不同剂量青蒿琥酯对鸡胚影响

图1 鸡胚照蛋及鸡胚病变图

由图1可以看出，125μg青蒿琥酯注射鸡胚尿囊腔后鸡胚血管全部脱落，鸡胚胎全身出血。空白对照组鸡胚血管完好，血管清晰，鸡胚胎无任何病变。

2.2 青蒿琥酯在鸡胚上急性毒性试验

∑p=1.3333

根据改良寇氏法，LD50=log-1[Xm-i(∑p-0.5)]

=log-1[0.3979-0.0739(1.3333-0.5)]

=log-10.3363=2.17mg/kg

可信限的求法: X=log-1(lgLD50±1.96*SX50)

=10(lg2.17±1.96*0.0174)

=2.01mg/kg～2.38mg/kg

由计算结果可得青蒿琥酯LD50为2.17mg/kg，换算成剂量为108.5μg，95%可信限为100.5μg～119μg，与实验结果一致。

表1 不同剂量青蒿琥酯注射液注射鸡胚死亡率统计(n=6)

注：按照改良寇氏计算方法，死亡率用小数表示

2.3 不同剂量青蒿琥酯对雏鸡生长影响

表2 用药前后雏鸡平均体重变化(n=6) g

用药前，各组雏鸡之间体重不具备显著统计学意义，表明各组体重相当。灌药第1天，高剂量组与其他各组差异显著(P<0.05)，溶剂对照组、中等剂量组、低剂量组与对照组无差异(P>0.05)；第2天高剂量组与对照组差异极显著(P<0.01)，用药组之间差异显著(P<0.05)，溶剂对照组与空白组无差异(P>0.05)，用药组与空白组差异极显著(P<0.01)；第3天高剂量组与对照组差异极显著(P<0.01)，高剂量组与中等剂量组和低剂量组间差异显著(P<0.05)；第4天高剂量组与对照组差异极显著(P<0.01)，高剂量组与中等剂量组和低剂量组间差异显著(P<0.05)。以上数据说明，高剂量青蒿琥酯能明显抑制雏鸡生长，随着剂量降低，青蒿琥酯抑制生长效应减轻，溶剂对照组(橄榄油)对雏鸡生长没有抑制作用，与空白对照组相比，橄榄油组生长速度稍快。

如表3所示，40 mg/kg组肝体比显著低于其他四组(P<0.05)，溶剂对照组与空白对照组之间无显著性差异(P>0.05)，说明溶剂对雏鸡肝脏无明显影响。高剂量组肝体比与中低剂量组之间有显著差异(P<0.05)，中等剂量组肝体比与低剂量组之间差异显著(P<0.05)，以上数据说明高剂量青蒿琥酯对肝脏的损伤较其他组严重，溶剂对照组对肝脏基本无损伤。

表3 各用药组雏鸡肝体比

2.4 雏鸡肝组织HE染色石蜡切片

由图2可以很明显地看出空白组与溶剂对照组肝细胞排列整齐，肝索明显。高剂量组肝组织结构紊乱，中等剂量组出现部分结构损坏，低剂量组无明显病变。结果表明，溶剂对肝脏没有损伤，高剂量青蒿琥酯能明显引起肝损伤。

图2 各组雏鸡肝脏H.E染色石蜡切片(40x)

3 讨论

目前，青蒿琥酯在鸡胚以及雏鸡上的毒性研究几乎没有报道。本研究从鸡胚与雏鸡两方面研究青蒿琥酯毒性，研究结果表明：青蒿琥酯在鸡胚上的LD50为2.17 mg/kg，40 mg/kg能明显抑制雏鸡生长。因此本研究结果揭示了青蒿琥酯存在胚胎毒性。

靳永刚等[9]用硫代巴比妥酸法测定静脉注射该药后大白鼠的肝、肠组织内丙二醛含量的变化，结果表明青蒿琥酯在体内、体外代谢过程中均可产生自由基，并可引发脂质过氧化和组织损伤。由此认为青蒿琥酯毒性可能是在代谢过程中产生的大量自由基作用于细胞膜，导致细胞损伤。青蒿琥酯可以导致线粒体功能障碍，从而引起ROS代谢障碍，发生氧化损伤，导致细胞裂解死亡[10]。有关研究表明，高剂量 Art(100～300 mg/kg,静注)能引起人和动物造血系统、肝脏和遗传毒性[11]。娄小娥等[12]的研究结果表明,大鼠在妊娠6～10 d给予Art,对胚胎具有显著的毒性作用,随剂量增高,吸收胎和死胎率明显增加。每日7.5mg/kg剂量组吸收胎率比对照组显著升高。细胞凋亡通常与线粒体损伤有关，李天星等[13]发现动物胚胎肝造血细胞比骨髓细胞对此药物更为敏感。

综上所述，Art结构中的过氧桥键不仅是其抗疟活性的重要基团，也是其毒性作用的原因之一[14]。青蒿琥酯对鸡胚急性毒性以及雏鸡毒性的作用机理尚不清楚，有待于今后深入研究。