不同剂量复合维生素对H9N2亚型禽流感病毒感染小鼠有效保护效果研究

董宏伟,郑 丰,李永彬

(河南省驻马店市动物疫病预防控制中心，河南 驻马店 463000)

H9N2亚型禽流感病毒属于低致病性禽流感病毒(LPAIV)，最早于1966年从患轻度呼吸道疾病的火鸡上分离得到，被命名为A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)[1]。近年来，H9N2亚型禽流感的流行变得日益频繁，给养禽业带来巨大经济损失，并对人类健康构成威胁，有效防治禽流感仍是一个亟待解决的难题。目前，控制禽流感的措施主要依赖于疫苗和抗病毒药。病毒抗原漂移或抗原转换带来的病毒持续变异，使AIV可逃逸动物机体已有的免疫应答，流感疫苗仅对亚型内抗原匹配较好的毒株具有免疫保护作用，往往对下一次的疫情起不到保护作用，难以应对流感大流行；流感病毒对抗病毒药物极易产生耐药性。

维生素在调节免疫过程中有广泛且重要的作用，比如淋巴细胞活化和增殖，辅助性T细胞的分化、组织特异性淋巴细胞归巢，特异性抗体产生和免疫反应的调节。VC、VE和B族维生素作为抗氧化剂，以非特异性的方式发挥免疫作用；而VA和VD有激素样特性，通过与核激素受体的相互作用，在免疫应答中发挥着关键作用，其代谢物在调节组织特异性免疫反应、预防或治疗炎症方面有一定潜力[2]。基于此，本试验采用高、中、低3个不同浓度的复合维生素给小鼠灌服，通过观察小鼠临床症状、存活状况、体温、体重和采食量的变化，以确定复合维生素给药剂量，从而增强对AIV的抵抗力，为H9N2亚型禽流感的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

手提式压力蒸汽灭菌器(YX-280D)(合肥华泰医疗设备有限公司)， 电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)，电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)， 超低温冰箱(上海精天电子仪器有限公司)， 垂直流超净工作台(上海智成分析仪器制造有限公司)，电子天平(上海第二天平仪器厂) 。

1.2 病毒及实验动物

A/Chicken/HB/4/2008(H9N2) EID50为10-8.78/0.2mL本课题组分离、保存。6-8周龄雄性SPF BALB/c系小鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)。

1.3 药品

Retinyl acetate(批号1001019413，Sigma公司)，维生素C注射液(批号 H20046089，辰欣药业股份有限公司)，维生素D2果糖酸钙注射液(批号 H44024177，天心制药有限公司)，(±)-α-Tocopherol(批号1001006848，Sigma公司)。

1.4 主要试剂的配制

生理盐水NaCl0.85g，去离子水100mL，完全溶解，高压灭菌。

0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O3.63g，KH2PO40.24g，去离子水900mL用盐酸调pH值至7.4，加去离子水定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存备用。

1万U/mL双抗液注射用青霉素80万单位，注射用链霉素80万单位，PBS80mL，完全溶解后，-20℃冻存备用。

1.5 观察不同剂量复合维生素对小鼠临床症状和存活率的影响

表1 不同组复合维生素的组分剂量

取6-8周龄18-20 g雄性SPF BALB/c系小鼠30只随机分为4组，按常规方法饲养。各组维生素剂量见表1。设置对照组，每天给小鼠灌胃复合维生素液或生理盐水200 μL，连续灌胃10 d，11 d时鼻腔接种A/Chicken/HB/4/2008(H9N2)病毒的感染性鸡胚尿囊液200 μL/只，每天观察小鼠的精神状态和死亡情况并作好记录，连续观察31 d。

1.6 数据处理与统计分析

试验数据以(X±SE)表示。用SPSS for Windows 13.0 统计软件包进行t检验(Independent samplettest),P<0.05判为差异显著。

2 实验结果

2.1 复合维生素对H9N2亚型禽流感病毒感染小鼠临床症状和存活状况的影响

攻毒组小鼠，在攻毒后第1天整体状态良好；攻毒后第2天开始出现精神沉郁，活动减少，扎堆，体温、体重和采食量均大幅下降；攻毒后第3天症状比较明显，大部分小鼠精神高度沉郁，不活动或活动缓慢，被毛粗乱无光泽，呼吸呈弓背呼吸，出现呼吸震颤音，表现出呼吸困难和呼吸窘迫等典型流感症状(图1A)，严重的呼吸窘迫持续3 d，存活小鼠从攻毒后第7天体征逐步恢复，第14天基本恢复至正常水平。维生素组也出现上述症状，但是症状较轻且高剂量维生素组症状最轻，恢复更早(图1B)。

图1 感染H9N2后第6天小鼠临床表现变化

存活率：感染后4-6 d为小鼠死亡高峰期，攻毒组在感染后开始死亡，观察期内攻毒组与维生素组存活率均为33%(6/18),对照组小鼠存活率为100%(图2)。维生素组小鼠开始死亡时间为144 h，比攻毒组小鼠110 h推迟了34 h，说明4种复合维生素对小鼠有一定的保护作用。

图2 维生素组以及对照组小鼠的存活曲线

2.2 不同剂量复合维生素对小鼠体温、体重等临床症状的影响

灌胃期间各组体温稳定，维持在37-38 ℃之间，接种病毒后，除对照组体温稳定，其余各组体温均呈现先下降后上升态势，攻毒组与各维生素组体温均在接种后第2天下降，攻毒组、低剂量维生素组和中剂量维生素组分别在第5、6、8天达到最低，高剂量给药组第2天达到最低，但最低值明显高于攻毒组，随后，各组恢复期间体温缓慢回升(图3)。

图3 维生素组以及对照组小鼠体温变化情况

对照组小鼠在实验期间体重缓慢上升，高剂量维生素组、中剂量维生素组、低剂量维生素组和攻毒组分别在攻毒后第3、7、8天下降至最低，高剂量维生素组明显高于对照组，且体重降低7%，明显低于其他组22%～30%。之后各组体重不断恢复，高剂量和中剂量维生素组体重始终高于攻毒组(图4)。

图4 维生素组以及对照组小鼠体重变化情况

接种病毒第2天，除对照组，其余各组采食量下降(图5)，第3天均降至最低点，下降和恢复期间，各组采食情况为：高剂量维生素组>中剂量维生素组>攻毒对照组>低剂量维生素组。

综合各组临床症状、存活状况、体温、体重和采食量的情况，高剂量维生素组和中剂量维生素组对H9N2亚型流感病毒起到一定保护作用，前者保护作用更好。

3 讨论

H9N2亚型禽流感病，于1966年首次从火鸡中被检测，现在已呈全球流行,其宿主范围不断扩大，包括人类、狗、猪、鸡、鸭、鹌鹑、野鸡、鹌鹑、鸽子、乌骨鸡、石鸡和白鹭等[70]。H9N2亚型禽流感通常不会引起明显的临床症状或鸡只死亡，表现为轻度的发病率和死亡率，但是与其他病原菌共感染则会给养殖业带来重大损失[4]。此外，H9N2亚型流感病毒已经在家禽中建立了稳定的种系，在多种宿主中流行并持续变异，如H6N1，H6N2、H5N1、H7N9和H10N8，可能产生感染人类的重组毒株，带来公共卫生安全隐患[3, 5]。因此，有效防控H9N2对养殖业危害和人类公共卫生安全具有双重意义。H9N2亚型禽流感病毒属低致病性病毒，常表现为隐性感染或仅表现轻微症状，未能引起人们足够重视；由于病毒不断变异和重组，疫苗保护效果不断下降；抗流感药物如金刚烷胺、金刚乙胺的频繁使用，已出现耐药性，对流感病毒的敏感性也越来越低。因此，需要继续寻求有效的防控H9N2亚型禽流感的方法。

维生素是人和动物必须从食物中获得的一类微量有机物质，在机体生长、代谢、发育过程中发挥重要作用。研究显示，不同维生素在麻疹、艾滋病、流感的预防或治疗上有一定作用。本实验采用高、中、低3个不同浓度的四种复合维生素给小鼠灌服，观察其对H9N2亚型禽流感病毒感染小鼠的保护效果。每天给予800 IU VA、25 mg VC、12 IU VD和3.2 IU VE的高剂量复合维生素组小鼠感染H9N2亚型禽流感病毒后精神状态、体温和采食量的维持明显好于其他组，尤其在体重方面，感染后体重降低7%，明显低于其他组22%～30%。本实验结果显示，高剂量复合维生素对H9N2亚型禽流感感染的小鼠能起到保护作用。