猪流行性腹泻病病毒RT-PCR分子诊断及部分S基因同源性分析

宋 浩，蒋增海，薛 杰，杨 凤，杨龙飞

(1.河南牧业经济学院 动物医学院，河南 郑州 450046；2.河南省猪病防控工程技术研究中心，河南 郑州 450046)

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)为猪流行性腹泻病(porcine epidemic diarrhea，PED)的病原，属于冠状病毒科中的冠状病毒属，单股正链RNA病毒[1]。PED的主要临床症状为呕吐、脱水和腹泻，是一种急性、高度接触性肠道传染病。各种年龄的猪均易感，但仔猪危害更严重，发病率可达100%。自2010年以来，PEDV的流行区域逐渐扩大，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失[2-3]。

PEDV只有一个血清型，存在4种结构蛋白：S蛋白、M蛋白、sM蛋白和N蛋白，还有一个位于sM蛋白和S蛋白之间的ORF3，主要编码一个功能未知的多肽性片段[4]。S蛋白由1383个氨基酸组成，划分为S1区和S2区，并且易发生变异，因此S蛋白经常被用来研究国内外不同毒株之间的亲缘性关系[5]。

2018年3月，河南省焦作市某猪场饲养母猪80多头，母猪所产15窝仔猪几乎全部发病死亡，出生后1～3日龄发病最严重，临床表现症状为呕吐、拉稀、吐奶和排黄色水样粪便。剖检发病仔猪，观察到小肠充血,肠管显著扩张，肠管内充满透明液体。内容物稀薄、呈黄色。初步怀疑为流行性腹泻病毒感染，取肠内容物进行猪流行性腹泻病毒RT-PCR分析检测，确诊为流行性腹泻病毒阳性。经了解，该猪场进行过流行性腹泻疫苗预防，具体免疫程序：使用传染性胃肠炎-流行性腹泻二联活疫苗，冬季所有猪只普防，怀孕母猪在临产前15d再次免疫。据调查该二联疫苗由经典毒株制备而成。为了分析疫苗免疫失败原因，将扩增的部分S基因产物送基因公司测序，然后将测序结果与其他毒株进行同源性分析，构建系统进化树，研究PEDV毒株之间的亲缘性。

1 材料与方法

1.1 病料

疑似猪流行性腹泻病猪小肠内容物，采集于河南省焦作市某猪场1周龄以后死亡的仔猪。

1.2 主要试剂

Trigol总RNA提取试剂盒(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。一步法高效RT-PCR试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)。DNA Marker(博迈德生物公司)。

1.3 病料处理

取一段猪小肠置于研钵中，剪碎并充分研磨，加入一定PBS(100mg加入200μL)，混匀，反复冻融2次,然后加入1mL Trigol,室温放置5min，使其充分裂解，之后放入-70℃冰箱保存或直接提取RNA。

1.4 病毒总RNA提取

根据Trigol试剂盒说明书进行，取1.3加入Trigol后的组织，12000rpm,离心5min，弃去沉淀，按200μL氯仿/mL Trigol比例加入氯仿，振荡混匀，室温放置15min(禁用漩涡振荡器)。之后放入离心机，4℃12000rpm离心15min,吸取上层水相，转移到另一EP管中，加入上清量0.7倍体积的异丙醇，室温放置15min,4℃12000rpm离心5min,弃上清。室温晾干5～10min,之后加入50μL ddH2O或TE buffer,放置5min,-20℃保存以用于RT-PCR检测。

1.5 引物设计和检测

参照GeneBank PEDV YN144S基因序列(登录号KT021232.1)，设计一对特异性引物PED-S1-P1、PED-S1-P2，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，扩增目的片段大小为969bp。

PED-S1-P1:5’-TCGCCATGGGGAACTGCCATTCAGCGTAT-3’;

PED-S1-P2:5’-CTAGGATCCCGTGGGTGCAATCTTGACTT-3’。

1.6 病毒样品RT-PCR检测

本研究采用一步法高效RT-PCR试剂盒检测，总反应体系25μL：One Step Enzyme Mix1μL、2×One Step Mix (Dye Plus)12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、RNA模板3μL、Rnase free ddH2O 补足至终体积25μL。PCR反应条件为：50℃30min、94℃预变性2min,之后进入循环94℃30s、退火温度62℃30s、72℃30s，34个循环后，72℃延伸10min。取PCR产物7μL，在琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统中观看有无特异性阳性条带，阳性条带送至生工测序。

1.7 部分S基因序列分析

将获得的部分S基因与在GenBank下载的22株PEDV毒株(表1)，利用DNAstar软件进行同源性分析并用MEGA5构建系统进化树。

表1 参考毒株来源及名称

2 结果

2.1 RT-PCR检测结果

取产物7 μL进行琼脂糖凝胶电泳，所得结果与预计扩增大小一致，目的片段为969bp(图1)。

图1 样品PEDV RT-PCR扩增结果

2.2 S基因序列同源性分析

检测毒株与2016年分离的CH-SCAY-2014野毒株同源性最高，为99.1%；与经典毒株CV777、韩国分离毒株DR13、Chinju99之间的同源性分别为94.8%、96.6%、92.9%；与2014-2017年GenBank登录的毒株之间的同源性较高，为98.1%～99.1%(图2)。

从进化树(图3)可以看出，分为2个分支：G1和G2。G1包括2011年福建毒株(XM1-2)、2016-2017年各地分离的毒株(XY1S、PC22A等)，其中检测毒株与XM1-2毒株亲缘性不如其它毒株。G2包括经典毒株CV777、韩国毒株DR13、Chinju99。

3 讨论

猪流行性腹泻在世界各地广泛流行，如美国、日本、中国、加拿大等国家都存在PED疫情[6-7]。据了解，近几年河南省的猪场不断发生猪流行性腹泻感染[8-9]。由于猪流行性腹泻与传染性胃肠炎临床症状相似，仅凭病理检查不容易鉴别，因此，常常通过实验室诊断技术，如RT-PCR、EILSA等来检测。其中RT-PCR敏感性更高、特异性更强，已成为病毒检测技术中应用最广泛的方法之一[10]。本试验采用RT-PCR法检测样品，结果为PEDV阳性，并经测序，将所测得序列进行序列分析。

经过查阅，2015-2016年李舜等[11]对广东省分离的16株毒株进行了S基因序列分析，结果显示其中15株毒株与经典株CV777亲缘性较远，同源性87.6%～88.2%，表明广东省目前流行毒株存在基因变异。吴旺霞等[12]对浙江省12株流行毒株的S基因进行研究，发现与经典毒株CV777同源性为93.3%～94.9%，说明浙江地区流行毒株也发生了变异。本试验所分离的PEDV流行毒株与经典株CV777同源性为94.8%，亲缘性较远，存在变异，与上述研究结果一致，这可能是该发病猪场疫苗免疫失败的重要原因之一。对于变异毒株的出现，传统PEDV疫苗可能无法保护猪群，我们建议猪场使用变异毒株疫苗来预防该病。

图2 PEDV不同毒株S基因遗传进化树

图3 PEDV不同毒株同源性比较结果

除了接种疫苗预防，我们还可以采用生物安全措施来预防该病。如：猪场及时干燥通风，定期对地面、设施、用具进行消毒，场区内的水槽、料槽定期清洁以及饲料保持干燥，粪便及时清理等。发病以后，应及时对发病猪场进行隔离消毒,隔离发病猪只, 及时对感染猪舍地面、用具等进行消毒,禁止相关人员进入正常猪舍,以避免交叉感染[13]。治疗方面，可以使用生物制品疗法：注射高免血清、干扰素等；或者中兽医学疗法：如徐国栋等[14]介绍，对不同地区的PED感染猪使用冠能注射液进行治疗，总治愈率为98%，效果满意。