青蒿琥酯纳米粒的制备及其体外细胞抑制试验

邢贞建，李 祥，陶 涛（广州市胸科医院，广州市 510095）

青蒿琥酯纳米粒的制备及其体外细胞抑制试验

邢贞建＊，李 祥，陶 涛（广州市胸科医院，广州市 510095）

目的：制备青蒿琥酯纳米粒，并对其性质及体外细胞抑制作用进行研究。方法：以聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）为载体，采用自乳化方法制备青蒿琥酯纳米粒。扫描电镜观察纳米粒的形态，激光粒度仪测定纳米粒的粒径及其分布；考察纳米粒的载药量、包封率、体外释放情况；MTT法考察纳米粒对人白血病细胞株K562在不同时间（24、48、72h）的体外细胞抑制率，并与青蒿琥酯（原料药）比较。结果：所制青蒿琥酯纳米粒为圆球形，表面光滑，平均粒径为（144±3.0）nm，Zeta电位是－31.5mV，平均载药量和包封率分别为14%、84%；体外释放试验前期有明显突释现象，前24h累积释放度为46%，其后释放均匀，120h累积释放度达65%，具有缓释作用；其在72h时对细胞抑制率高于青蒿琥酯组（76.4%vs.59.1%），有较强抑制作用（P＜0.05）。结论：所制青蒿琥酯纳米粒在体外具有较好的缓释性，对K562细胞有较强的抑制作用。

青蒿琥酯；纳米粒；聚乳酸-羟基乙酸共聚物；制备；K562细胞；抑制作用

青蒿琥酯（Artesunate，ART）是具有倍半萜结构的抗疟药，化学名为二氢青蒿素-1，2-α-琥珀酸单酯。较之青蒿素，青蒿琥酯水溶性更好，效价更高，不易产生耐药性，且其代谢产物二氢青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）抗疟活性高，毒性小[1]。另有研究[2]发现，青蒿琥酯还具有抗肿瘤的作用。但是，青蒿琥酯同时也具有诱导肝药酶的作用，首关效应明显，且在体内代谢快，因此，现有的片剂、注射剂都具有上述缺点，故改进青蒿琥酯给药方式、维持其体内浓度成为临床需要。纳米制剂具有提高药物稳定性、延长作用时间及对肝、脾等部位有靶向性等优点[3]；而聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）具有生物降解性，最终降解为水和二氧化碳，生物安全性高，是理想的药物载体[4]。因此，笔者选用PLGA为载体制备青蒿琥酯纳米粒，同时考察其性质，探讨青蒿琥酯纳米制剂的可行性。

1 仪器与材料

Rotavapor R-114旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；Zeta-sizer 3000HS激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）；TMP电子天平（德国Sartorius公司）；JSM-6330F型扫描电镜（日本电子株式会社）；Waters 2487型高效液相色谱（HPLC）系统（美国Waters公司）。

PLGA（50/50，山东岱罡生物材料有限公司，相对分子量：15000）；青蒿琥酯原料药（广西桂林南药有限公司，批号：070519，纯度：＞98%）；青蒿琥酯、二氢青蒿素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：100200-200202、100184-200401，纯度：均＞98%）；泊洛沙姆（型号：188）、MTT、二甲基亚砜（DMSO）均由美国Sigma公司提供；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；青蒿琥酯纳米粒（自制，规格：每100mg含青蒿琥酯14mg）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

人白血病细胞株K562（购自中国医学科学院血液学研究所）。

2 方法与结果

2.1 青蒿琥酯纳米粒的制备

采用自乳化方法制备纳米粒[5]。精密称取24mg青蒿琥酯和120mg PLGA共溶于10mL油相中（丙酮-无水乙醇＝9∶1），将油相缓慢滴加到中速搅拌的0.1%泊洛沙姆水溶液60mL中。搅拌一段时间后，将上述溶液减压旋转蒸发至无丙酮气味，然后于0.22μm滤膜过滤，得到纳米胶体溶液。将该溶液于4℃超速离心（20000r·min－1）0.5h，沉淀加蒸馏水洗涤，同法再离心、洗涤3次，冷冻干燥得到青蒿琥酯纳米粒。空白纳米粒除不加药物外，其余同法制备。

2.2 纳米粒的形态学及粒径考察

使用激光粒度仪测定纳米粒的粒径分布及Zeta电位，扫描电镜下观察纳米粒的形态。

测定结果表明，纳米粒表面带负电荷，Zeta电位是－31.5mV。粒径分布较窄，且基本呈正态分布，平均粒径是（144±3.0）nm，多分散指数为0.155。扫描电镜显示，纳米粒为类球形，表面光滑，大小均匀，粒子间基本无黏连。粒径分布和纳米粒形态分别见图1、图2。

2.3 药物含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验色谱图。色谱柱：Ecosil C18（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.02mol·L－1硫酸铵溶液-12%三乙胺溶液（60∶40∶0.2，稀氨水调pH至4.5）；流速：1.0mL·min－1；进样体积：20μL；柱温：室温；检测波长：210nm。

取空白纳米粒、青蒿琥酯标准品、二氢青蒿素标准品和样品制备成溶液后进样分析，色谱见图3。

图1 青蒿琥酯纳米粒的粒径分布Fig 1 The particle size distribution of Artesunate nanoparticles

图2 青蒿琥酯纳米粒扫描电镜照片（×400000）Fig 2 Scanning electron micrographs of Artesunate nanoparticles（×400000）

图3 高效液相色谱图A.空白纳米粒；B.青蒿琥酯标准品；C.二氢青蒿素标准品；D.供试品；1.青蒿琥酯；2.二氢青蒿素Fig 3 HPLC chromatograms A.blank nanoparticles；B.artesunate standard substance；C.dihydroartemisinin standard substance；D.test sample；1.artesunate；2.dihydroartemisinin

2.3.2 标准品溶液。精密称取青蒿琥酯和二氢青蒿素标准品，加入乙腈溶解成一定浓度，作为标准品贮备液。再分别取该贮备液适量，用乙腈稀释制成含青蒿琥酯分别为25、50、100、200、300、400、500μg·mL－1和含二氢青蒿素分别为10、20、30、40、50、100μg·mL－1的系列标准品溶液，备用。

2.3.3 线性关系考察。分别精密取“2.3.2”项下标准品溶液20μL进样，以色谱峰面积（A）对标准品浓度（c）进行线性回归。结果，青蒿琥酯的线性方程为c＝0.0018A+22.03（r＝0.997），线性范围为25～500μg·mL－1，保留时间是8.268min；二氢青蒿素的线性方程为c＝0.0014A+23.6（r＝0.998），线性范围为10～100μg·mL－1，保留时间是8.764min，见图3。

2.3.4 精密度试验。取“2.3.2”项下标准品溶液（含青蒿琥酯和二氢青蒿素分别为200、30μg·mL－1），连续进样6次。结果，青蒿琥酯和二氢青蒿素峰面积的RSD分别为1.6%（n＝6）和1.5%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.5 重复性试验。取一定量青蒿琥酯按“2.1”项下方法操作制备纳米粒，测定其中青蒿琥酯和二氢青蒿素的浓度。结果，二者RSD分别为2.8%（n＝6）和2.5%（n＝6），表明本方法重复性较好。

2.3.6 回收率试验。精密量取1mL空白纳米粒溶液9份，置于5mL容量瓶中，分别加入适量青蒿琥酯和二氢青蒿素标准品溶液，乙腈定容，使青蒿琥酯的浓度为200、300、400μg·mL－1，二氢青蒿素的浓度为40、50、60μg·mL－1，每个浓度3份样品。高速离心，进样20μL。结果，青蒿琥酯和二氢青蒿素的平均回收率分别为99.4%（n＝9）和101.4%（n＝9），RSD分别为0.81%（n＝9）和2.07%（n＝9），表明本方法的准确度高。

2.4 纳米粒的载药量、包封率测定

收集“2.1”项下超速离心后的纳米胶体溶液的上清液及洗液，采用HPLC法检测其中药物含量。精密称取适量冻干的纳米粒，加入少量二氯甲烷使纳米粒完全溶解，挥干有机相，乙腈溶解残渣，高速离心后进样检测。载药量＝（纳米粒中药物量/纳米粒重量）×100%；包封率＝[（加入总药量－上清液中游离药量）/加入总药量]×100%。

结果，纳米粒平均载药量为14%（n＝3），平均包封率为84%（n＝3）。

2.5 纳米粒的体外释放

采用动态透析法测定纳米粒的体外释放情况[6]。精密称取一定量纳米粒，置于10mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）中，超声分散，37℃、100r·min－1恒温搅拌。分别在0.5、1、2、3、4、6、8、10、24、36、48、72、96、120h时各取1mL，超速离心取上清液；同时补加等量新鲜PBS。HPLC法检测上清液中的药物含量，计算累积释放度，将累积释放度与时间作图得体外释放曲线，见图4。

图4 青蒿琥酯纳米粒体外释放曲线Fig 4 In vitro drug release curves of Artesunate nanoparticles

由图4可见，纳米粒在体外有较好的缓释性，前期有明显突释现象，前24h累积释放度为46%，其后释放均匀，120h累积释放度达65%。

2.6 纳米粒的体外细胞抑制作用

采用MTT法检测细胞存活率。将人白血病细胞株K562置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃、5%CO2常规培养。选择对数生长期细胞，调整细胞数为5×105个/mL接种于96孔培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每孔200μL。试验组分为3组，青蒿琥酯纳米粒组、青蒿琥酯（原料药）组和空白纳米粒组，对照组为未加任何物质的培养基。根据资料[7]，设定青蒿琥酯纳米粒组和青蒿琥酯组的浓度均为0、5、10、20、40μmol·L－1，每个浓度设8个复孔，分别于24、48、72h每孔加入5g·L－1MTT溶液20μL，孵育4h，弃上清液，加入DMSO终止反应，微振荡后，用酶标度光度计在波长570nm测定每孔的吸光度，并计算各组的细胞增殖抑制率，重复3次。细胞增殖抑制率＝（1－A试验组/A对照组）×100%（A为吸光度）。即吸光度越大，抑制率越小。

试验所得数据以均数±标准差（x ±s）表示，应用SPSS 13.0软件进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果表明，不同浓度青蒿琥酯纳米粒与K562细胞共同孵育后，细胞生长受到抑制，并呈剂量依赖性。在3个不同的时间段，各浓度的抑制率都在72h达到最高峰，其中20μmol·L－1浓度的青蒿琥酯纳米粒与其他浓度相比，抑制率具有显著性差异（P＜0.01）。青蒿琥酯纳米粒组与空白纳米粒组、青蒿琥酯组在24、48、72h的吸光度相比，均有显著性差异（P＜0.05），其中24、48h青蒿琥酯纳米粒组抑制率小于青蒿琥酯组，而在72h抑制率则高于青蒿琥酯组，呈时间依赖性。结果详见表1、表2。

表1 72h时不同浓度青蒿琥酯纳米粒组吸光度值和抑制率比较（x ±s，n＝8）Tab 1 Comparison of absorbance and inhibition rate of different concentrations of Artesunate nanoparticles at 72h（x±s，n＝8）

表2 20μmol·L－1浓度时各组不同时间点吸光度值和抑制率比较（x ±s，n＝8）Tab 2 Comparison of absorbance and inhibition rate of different group of 20μmol·L－1at different tim（ex ±s，n＝8）

3 讨论

青蒿琥酯在水中很快水解成二氢青蒿素，而发挥药理作用的也是二氢青蒿素，因此青蒿琥酯可以说是一个前药[8]。纳米粒形成后青蒿琥酯包封在PLGA载体里，可减少酯键的水解，保持稳定；同时，青蒿琥酯被聚酯类载体包裹后其降解产物绝大多数是二氢青蒿素；另PLGA作为载体本身对细胞毒性很小，用其制备的纳米粒，后期可能因降解出乳酸使细胞生长的微环境pH值降低，从而抑制细胞生长。因此，青蒿琥酯采用PLGA为载体制备纳米制剂有利于药效的发挥[9]。

有研究[10]发现，青蒿琥酯单药对白血病和结肠癌细胞株作用最强，对非小细胞肺癌细胞株作用最弱。因此，青蒿琥酯在抗白血病方面可能具有较大潜力，故本试验选择K562细胞，该细胞是慢性粒细胞白血病细胞系中的一种。青蒿琥酯纳米粒在体外对其有抑制作用，提示青蒿琥酯纳米粒可能对白血病的治疗有益。

关于青蒿琥酯的含量测定方法，已有许多文献报道，如RP-HPLC法[11]、HPLC-碱水解-UV法[12]等。其中，HPLC-UV是最常用的方法，但青蒿琥酯本身紫外吸收波长在近紫外区（210nm左右），一般直接测定比较困难，有研究者先把青蒿琥酯水解后再进行测定[13]。由于水解受温度、pH、时间等因素影响，因此，对各因素控制要求严格，操作条件的不同可致稳定产物的量有明显差异。本试验参考以上文献，经多次试验后采用本文所述色谱条件，结果表明有较好的效果。

自乳化方法制备的纳米粒粒径较小，表面带负电荷，适合静脉给药。在体外，青蒿琥酯纳米粒具有较好的缓释性，由此推测其在体内可能也具有较好的缓释性，从而延长青蒿琥酯的作用时间，克服其半衰期短的缺点。本文中的细胞试验表明，青蒿琥酯纳米粒对K562细胞有较强的抑制作用，且此作用呈剂量和时间依赖性。青蒿琥酯纳米粒组在24、48h的抑制效果不如青蒿琥酯组，可能是由于开始时青蒿琥酯浓度较高，对细胞有显著作用，但随着时间的增加，青蒿琥酯逐渐被代谢消失，而青蒿琥酯纳米粒则始终保持一定的浓度释放，如青蒿琥酯纳米粒组72h时抑制率高于青蒿琥酯组。在体内，青蒿琥酯或二氢青蒿素的半衰期只有几十分钟，因此，青蒿琥酯会很快被代谢，很难像体外一样保持稳定浓度。而青蒿琥酯经PLGA包裹成纳米粒后，可以防止药物被迅速代谢，从而控制药物释放，延长作用时间。

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Preparation of Artesunate Nanoparticles and Its in Vitro Cell Inhibition Test

XING Zhen-jian，LI Xiang，TAO Tao（Guangzhou Municipal Chest Hospital，Guangzhou 510095，China）

OBJECTIVE：To prepare Artesunate nanoparticles，and to investigate their characteristics and inhibitory effect on cell in vitro.METHODS：Spontaneous emulsion solvent diffusion method was used to prepare Artesunate nanoparticles using poly（lactide-co-glycolide）（PLGA）as carrier.Then their morphology was detected by scanning electron microscorpe.The particle size and its distribution of nanoparticles were determined by laser particle measurer.The drug-loading amount，encapsulation rate and drug released characteristics were identified.The inhibition effects of nanoparticles on K562cells at different time（24h，48h，72h）were determined by MTT assay and compared with that of artesunate raw material.RESULTS：Prepared Artesunate nanoparticles were spherical and uniform with mean diameter of（144±3.0）nm.Zeta potential was －31.5mV.Their mean drug-loading amount and encapsulation rate were 14%and 84%，respectively.At early period of in vitro release test，Artesunate nanoparticles released suddenly.At first 24h，accumulative drug release rate was 46%and showed significant sustained release.Accumulative drug release rate was 65%at 120h.At 72h，cell inhibition rate of Artesunate nanoparticles was higher than that of artesunate raw material（76.4%vs.59.1%）.The inhibitory effect on K562cells of Artesunate nanoparticles was significant（P＜0.05）.CONCLUSION：Prepared Artesunate nanoparticles are characterized with sustained-release property.Artesunate nanoparticles can inhibit K562cells proliferation efficiently in vitro.

Artesunate；Nanoparticles；PLGA；Preparation；K562cells；Inhibition effect

R943；R979.1

A

1001-0408（2011）25-2357-04

2010-12-04

2011-04-08）