贮存温度及形态对甜樱桃花粉耐贮性的影响研究

张 琦,刘 涛,王雅楠,支玉玺,高庆，蔡宇良*

( 1.西北农林科技大学园艺学院；2.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；3.武功县园林工作站，陕西武功 712200)

欧洲甜樱桃(Cerasusavium)为蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)植物[1]，又称甜樱桃、西洋樱桃、大樱桃，欧洲甜樱桃较中国樱桃、毛樱桃、酸樱桃有着外形美观、鲜艳亮泽、果实大、果肉多厚且柔软多汁、味道甜美、口感好、耐储运等明显优点。樱桃素有“百果第一枝”、“水果中的钻石”等美誉，春末夏初(4月下旬至6月下旬)成熟，樱桃的上市填补了新鲜水果的市场空白，对调节鲜果供应、平衡市场供需与满足人民对美好生活的需要有很大的意义和作用[2]。此外樱桃加工产品以其营养健康、种类丰富和较高品质广泛受到市场和消费者追捧。甜樱桃以其优良的果品特性、较高的商品价值、较早的上市时间近年来一直将我国樱桃产业的主导地位牢牢占据[3]。

樱桃为雌雄同花，中国樱桃与酸樱桃花粉多、自花结实能力强，除艳阳、拉宾斯、斯坦勒、斯塔克、艳红等少数品种有较高的自花结实能力外大部分甜樱桃品种都明显的自花不实，而且品种之间的亲和性也存在很大不同。在果树生产中，往往因为果园中搭配的授粉树少、品种不合理，加之受到天气影响，例如果树在花期遭遇大风、低温而造成蜜蜂不能进行正常的自然授粉而造成产量、品质下降，同时随着设施农业的发展，甜樱桃设施保护地栽培的大力推广，由于其栽培环境与生长习性的改变，出现了花粉生活力普遍较低的现象，其中有的甚至不足10%，较低的花粉生活力是设施樱桃开花却不坐果的主要原因之一[4]。对于自花不实的果树提高结实率的最关键、最有效途径就是进行品种间的异花授粉，同时人工授粉也是杂交选育樱桃新品种、提高樱桃品质、抵抗花期恶略自然环境的重要途径，而通过授粉受精获得优质、丰产，培育出新品种的基础就是花粉生活力，果园的产量和杂交试验的成败直接受到花粉数量多少和生活力高低的影响[5]。因此，通过建立花粉预备制度，提前采集自然条件下的高生活力花粉进行贮存保鲜，待大田甜樱桃花期遇到不良天气、大棚甜樱桃花期、开展杂交育种工作时进行人工授粉可以促进甜樱桃生产、科研的优质、高效[6]。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验地点

1.1.1 试验材料

供试材料有：先锋、艳阳、吉美、雷尼、斯坦拉共5个甜樱桃品种花粉，2017年4 月初、2018年3月中下旬于陕西省西安市周至县二曲镇渭中村西北农林科技大学渭河樱桃试验示范站和陕西省宝鸡市眉县试验站采集，分别用于花粉生活力测定、贮存试验和花粉数量、含水量的测定。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉的采集、制作、保存

(1)花粉的采集制作

根据花的开放程度分时对先锋、艳阳、吉美等5个不同甜樱桃品种分别采集花朵以收集花粉。在各品种花蕾期采集雄蕊松散、花药变黄但尚未开放的“铃铛花”，每个品种采集至少500朵花，采下后立即放入4 ℃恒温冰箱内。在避风条件下迅速用镊子将花药从雄蕊上剥离，将各个品种花药分品种标记后，分别置于25 ℃条件下烘干24 h。

(2)研磨前处理

花粉保存形态设置花药和花粉两个水平，待花药干燥后，将一部分干燥好的花药进行研磨处理，研磨时将花药放在硫酸纸纸夹层中，使用光滑的器具轻轻反复研磨，将未散粉的花药壁挤破，使其中的花粉充分释放出来，研磨时要注意研磨力度，谨防机械损伤导致花粉破裂而失活，将释放出来的花粉过60目筛后收集至离心管中；另一部分直接收集在离心管中，用密封纸、锡箔包裹两层后做好标记装入自封袋中。

(3)贮存温度试验处理

花粉贮存温度分为4个水平，将花药、花粉分别置于室温(14～19 ℃)和4、-20、-80 ℃恒温条件下。各处理重复3次。

1.2.2 花粉数量测定 采用蔗糖悬浮液法和果胶酶酶解法对吉美、艳阳、先锋三个甜樱桃品种花粉数量进行测定，将两种悬浮液的测定效果进行对比，分别选用载玻片直接计数法和血球计数板法测定单克花粉量和单药出粉量，重复6次[7-8]。单药花粉量和单克花粉量计算公式如下：

单药花粉量(粒)=(每个载玻片上总花粉粒数×200)/12

单克花粉量(粒)=5个中方格的花粉粒数/5×10×103×100

1.2.3 花粉含水量测定 采用王小敏等[9]的烘干法测定花粉含水量，将新鲜花粉置于干燥的称量盒中，烘箱设定温度25 ℃，待24，48，72 h直至恒重取出测定重量，通过计算得出各品种花粉含水量值。

花粉含水量=(W2-W3)/(W2-W1)×100%(W1为干燥的称量盒重，W2为称量盒内放入花粉后重，W3为干燥后恒重)。

1.2.4 花粉生活力测定 取已灭菌的洁净双凹载玻片，在载玻片凹处滴加经灭菌后的15%蔗糖、15 mg·L-1硼酸、0.5%琼脂的培养基溶液[10]2～3滴，确保盖玻片盖上后不溢出，待培养基溶液凝固后，将少许花粉粒播于培养基中，盖上盖玻片。于23～25 ℃组织培养室内培养48 h[11]后在显微镜下观察花粉萌发和花粉管生长的情况，以花粉管伸长超过花粉直径为标准[12]。每品种重复3次，各重复按梅花法随机选取5个视野进行观察，每个重复中观察不少于100粒花粉，进行统计计算。

花粉生活力=(花粉管长度大于花粉粒直径的花粉数量/观察花粉数量)×100%

1.3 数据处理

用Microsoft Office Excel 2016软件作图并进行差异显著性检验。

2 结果和分析

2.1 花粉含水量

对斯坦拉、艳阳、先锋、雷尼、吉美5个甜樱桃品种进行花粉含水量测定，各品种花粉分别在称量瓶内烘干24，48，72，72，96 h达到恒重，花粉含水量测定结果见表1，晚熟品种吉美花粉含水量最高为68.62%，分别高出中熟品种艳阳、先锋、雷尼花粉10.34%，19.99%，24.5%，高出早熟品种斯坦拉28.97%，。此外，不同品种花粉在25 ℃条件下烘干24 h后平均含水量不同，为4.98%～6.10%，从高到低依次为吉美、艳阳、先锋、雷尼、斯坦拉。

表1 不同甜樱桃品种花粉含水量 单位：%

注：表中“±” 后数字表示标准偏差，下同。

2.2 花粉数量

采用果胶酶酶解法所测得的单药出粉量、单克花粉量如表2所示。先锋、吉美、艳阳的单药平均出粉量分别为2 711粒、2 120粒、1 952粒。其中，先锋的单药出粉量分别较吉美和艳阳高27.88%和38.88%，而吉美和艳阳的单药出粉量无显著差异。吉美、艳阳、先锋的单克花粉量分别为51.3×106，20.0×106，50.4×106。其中，先锋和吉美的单克花粉量显著高于艳阳，而前两者间无统计学差异。

表2 不同品种甜樱桃花粉数量 单位：粒

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

据采集时统计，吉美、艳阳、先锋的单花出药量分别为30粒、32粒、38粒，由表2可计算出吉美、艳阳、先锋三种甜樱桃的单花出粉量，计算结果表明，在三种供试甜樱桃中，单花出粉量最多的先锋为103 000粒，其次为吉美64 000粒，艳阳最少为62 000粒。

2.3 花粉生活力

25 ℃烘干24 h后采用花粉离体培养法测定的吉美、艳阳、先锋、雷尼、斯坦拉等5个甜樱桃品种花粉生活力如图1所示，可看出5个品种中先锋花粉生活率最高，为66.74%，艳阳次之，为49.29%，雷尼花粉生活力最低为43.44%。可见在25 ℃烘箱内烘干24 h后花粉生活力仍保持较高的水平。

图1 不同品种甜樱桃25 ℃条件下烘干24 h的花粉生活力)

2.4 贮存形态对花粉生活力的影响

由图2可知，在室温和4 ℃条件下吉美、先锋以花粉形态贮存与以花药形态贮存的效果大致相同，艳阳以花药形态贮存的花粉生活力高于以花粉形态贮存的花粉，其差值最高可达27.24%，其中4 ℃条件下以花粉形态贮存的艳阳花粉完全失活时间早于以花药形态贮存的花粉最长，可达90 d。在-20 ℃和-80 ℃下保存，吉美前7 d中以花粉形态贮存的花粉生活力高于以花药形态贮存的花粉，随后低于以花药形态贮存的花粉，在-20 ℃第225 d时，其差值达到最大值，为28.77%；艳阳以花药形态贮存的花粉生活力在贮存过程中均高于以花粉形态贮存的花粉生活力，在第255 d时差值最大为32.98%；先锋在长期贮存过程中，除-80 ℃温度下第285 d外，以花药形态贮存的花粉生活力仅略高于以花粉形态贮存的花粉生活力。总体上看，长期贮存过程中以花药形态贮存的花粉生活力高于花粉形态贮存的花粉。

2.5 贮存温度对花粉生活力的影响

室温下吉美、艳阳、先锋三种甜樱桃花粉生活力均在贮存前5 d内明显下降，15 d时花粉生活力均降低至10%以下，45 d时完全失去生活力。可见，室温不适用于花粉的贮存。在贮存的第45 d后，在4、-20、-80 ℃温度条件下贮存的花粉生活力下降速度较之前逐渐放缓。贮存时间达120 d后花粉生活力呈现明显降低趋势，4 ℃降低最快，-20、-80 ℃贮存的花粉生活力损失较小。在4 ℃中贮存的花粉在第165 d时出现多数萌发率、染色率为零的视野，萌发率降低至10%左右，此时贮存价值较低，吉美、艳阳在第195 d即完全失活，先锋在贮存第315 d完全失活，已失去贮存价值。贮存第225 d时，在-20 ℃下贮存的艳阳花粉生活力降低至37.92%，与贮存前相差近11个百分点。各品种-80 ℃下贮存的花粉生活力与-20 ℃温度下贮存的花粉基本相当，随着贮存时间的延长，观察到的花粉管长度呈渐短趋势，花粉萌发的一致性较未贮存之前差。当花粉在-20、-80 ℃继续贮存至365 d时，各品种花粉生活力均有较为明显的下降，各品种花粉生活力为23.32%～36.22%。可见，甜樱桃花粉在-20 ℃和-80 ℃温度条件下进行周年贮存可满足科研和生产中人工授粉对花粉生活力的需求。

3 讨论与结论

甜樱桃单药花粉量分为5类，粒数小于700粒为极少量，201～1 400粒的为少量，1 401～2 100粒为中等，2 101～2 800粒为多，2 800粒以上为极多[13]，吉美、先锋单药出粉量多，而艳阳出粉量中等。度的干燥有利于花粉的保存，20%以下的花粉含水量有利于桃花粉超低温保存其中以13%～21%最佳[14]，蔗茅花粉含水量在10%以下、垂丝海棠花粉含水量为10%时置于低温条件下可延长其贮存时间[15-16]。本试验中吉美、艳阳、先锋、斯坦拉、雷尼五个甜樱桃花粉总含水量在介于39.65%～68.62%间，且含水量越高的花粉表现出的花粉生活力越低。在25 ℃温度条件下烘干24 h后含水率降至4.98%～6.1%，此时花粉生活力为43.44%～66.74%，可见在25 ℃烘箱内烘干24 h可作为花粉贮存前的干燥处理方法，但25 ℃烘干24 h是否是甜樱桃贮存前最适宜的干燥处理组合，甜樱桃花粉含水量与花粉生活力、花粉耐贮存性之间的关系有待进一步设计试验探究。

虽然花蕾期花粉生活力显著低于盛花期[5]，但考虑到花粉纯度等方面因素，本试验采集铃铛花进行花粉样本收集。本试验在前人研究[11,13,17-18]的基础上，对陕西省主栽和示范推广的5个品种花粉生活力进行了测定，其结果与前人研究结论较为一致。本试验表明以花药形态贮存的花粉较以花粉形态贮存的花粉有更好的耐贮存性，原因可能是花药的含水量较高的花药壁具有保护作用；为提高花粉保存后的生活力，生产中花粉研磨操作规程有待进一步试验研究。

果树花粉冷冻保存被认为是所有研究贮存模式中最有利的一种，前人的研究品种多局限在当地主栽品种，本试验探索了陕西省优质品种花粉的长期保存，为跨时间、跨地域的科学研究和生产实践提供了参考。甜樱桃花粉对贮藏条件敏感，室温不适于甜樱桃花粉贮存，其贮存时间不应超过11～13 d。低温可影响花粉贮存中的活力保持，吉美、艳阳、先锋三种甜樱桃花粉可在4 ℃条件下进行2.5个月以内的短期贮存，但在-20 ℃低温和-80 ℃超低温条件下可以实现周年贮存，且均能保持贮存前40%以上的花粉生活力，可满足授粉需要，花粉在两温度下贮存效果相差不大，考虑到实际生产条件和成本，建议选择在-20 ℃低温条件下对甜樱桃花粉进行贮存。低温保存花粉会出现“冷刺激”效应，生活力呈增加趋势[19]，本试验低温贮存中花粉生活力降低可能是在取样过程中由于冰箱与室外温度差导致花粉吸水造成花粉含水量升高，且过程中未及时做干燥处理造成的。在生产中应选择可与主栽品种授粉、花粉数量多、花粉生活力强的品种生产花粉，吉美、艳阳、先锋三个品种甜樱桃花粉均适宜作为花粉生产品种，其中以先锋最为适宜。