芪苈强心颗粒对心肾综合征大鼠肾组织细胞凋亡的影响*

段晓宇，朱 虹，孙 珊，胡红玲，卜晓芬，明小燕，贺映侠

(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院综合二科， 湖北 武汉 430014)

心肾综合征(cardiorenal syndrome，CRS)是指心、肾同时出现功能紊乱而导致病理生理变化的临床综合征[1]。临床上，心、肾疾病共存可显著增加患者的病死率和致残率[2]。目前，CRS的治疗主要集中在纠正血流动力学紊乱和肾脏的替代治疗上，但这种既要降低心脏负荷，又要保证肾脏血流灌注量的治疗方式本身就具有一定的矛盾性。如何合理避免这一矛盾的出现，是提高CRS治疗效果、改善患者病情的关键。芪苈强心颗粒(Qiliqiangxin granule, Q)是一种我国传统中药复方制剂，是一种被我国食品药品监督管理局批准用于心衰的临床用药。金敬顺等[3]研究表明，芪苈强心颗粒不仅可以改善心衰合并肾损伤患者的心功能，还对患者肾脏功能有一定的改善作用；卢金萍等[4]已证实，芪苈强心颗粒能够明显改善老年慢性心肾综合征患者的心肾功能，并无不良反应发生。然而，有关芪苈强心颗粒对CRS患者肾功能保护作用的机制研究鲜有报道。为此本研究拟采用左冠状动脉前降支结扎结合肾脏急性缺血再灌注损伤的方法建立急性CRS大鼠模型，探讨芪苈强心颗粒对急性CRS模型大鼠肾功能改善的机制，以期为提高CRS治疗效果提供更充分的理论基础。

材 料 和 方 法

1 实验动物

SPF级SD大鼠80只，雄性，6～7周龄，220～250 g，购自于武汉大学动物实验中心，动物合格证编号为SCXK(鄂)2017-0018。饲养环境保持昼夜12 h节律，恒温25 ℃，相对湿度40%～70%，通风换气8次/h，自由饮食。

2 主要试剂

芪苈强心胶囊购自于石家庄以岭药业股份有限公司(批号A1705005)，称取芪苈强心颗粒12 g，加入30 mL生理盐水溶解，配成400 g/L的溶液；抗血管紧张素II (angiotensin II，Ang II)、Bax和 Bcl-2抗体均购自Abcam；抗GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology；大鼠血管紧张素 II酶联免疫吸附测定试剂盒、大鼠中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)酶联免疫吸附测定试剂盒和大鼠胱抑素 C(cystatin C，Cys-C)酶联免疫吸附测定试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；肌酐(creatinine，Cre)测定试剂盒(货号C011-2)购自南京建成生物工程研究所；TUNEL凋亡检测试剂盒购自Roche。

3 主要方法

3.1实验分组及动物模型制备 将80只大鼠按照体质量随机分成6组：2周假手术(2-week sham operation，2w sham,n=10)组、2周模型(2-week CRS, 2w CRS,n=15)组、2周药物(2 weeks CRS-Q, 2w CRS-Q,n=15)组、4周假手术(4w sham，n=10)组、4周模型(4w CRS,n=15)组和4周药物(4w CRS-Q,n=15)组。2w CRS组、2w CRS-Q组、4w CRS组和4w CRS-Q组均采用左冠状动脉前降支结扎结合肾脏急性缺血再灌注损伤制备CRS:采用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，备皮消毒，打开腹腔，暴露分离左右侧肾蒂，结扎阻断30 min后解除阻断，恢复血流，完成肾脏急性缺血再灌注损伤；另沿左侧第5肋间切口，切开胸腔，显露心脏，在左耳与肺动脉根部之间、肺动脉根部2 mm左右，用6-0带针的手术丝线，缝扎左冠状动脉前降支。肉眼可观察左心室壁由红色变为苍白色，同时结扎远端心肌活动度减弱或消失，表明心肌梗死模型建立。2w sham组和4w sham组大鼠仅暴露器官或血管，不做任何缺血再灌注及结扎处理。术后腹腔滴入庆大霉素预防感染，关闭腹腔和胸腔。

3.2给药方法 手术后第1天开始进行药物干预，2w CRS-Q组大鼠给予4 g·kg-1·d-1芪苈强心颗粒灌胃治疗2周，4w CRS-Q组大鼠给予4 g·kg-1·d-1芪苈强心颗粒灌胃治疗4周。各模型组和假手术组给予相同体积生理盐水灌胃处理。

3.3标本取材 (1)24 h尿液：于取材前 1 d 放置代谢笼，收集24 h尿液，3 000 r/min离心20 min，取上清-80 ℃保存待检；(2)血清：采用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，剖腹暴露腹主动脉并采血，不抗凝收集血清或抗凝收集血浆于-80 ℃保存待检；(3)肾组织：采血后取肾脏组织，生理盐水冲洗干净后分成2部分，分别置于4%多聚甲醛固定后进行石蜡包埋保存和-80 ℃冷冻保存。

3.4生化指标检测 采用肌氨酸氧化酶法检测血清Cre含量；采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定血清Cys-C、尿NGAL和尿微量白蛋白(urine microalbumin,UMA)等含量；采用竞争酶联免疫吸附测定血浆Ang II含量。

3.5HE染色观察肾脏组织的病理变化 取大鼠肾脏组织蜡块切片，切片厚度为4 μm，置于65 ℃恒温烘箱烤片6 h左右。将组织切片经过梯度乙醇常规脱蜡至水，经苏木精-伊红染色、二甲苯透明后中性树胶封片，光学显微镜下观察。

3.6RT-qPCR检测肾脏组织Ang II、Bax和Bcl-2的mRNA表达 取部分冻存肾脏组织，用TRIzol法提取总RNA，采用紫外分光光度计测定RNA纯度及浓度，利用TaKaRa逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以逆转录的cDNA为模板，扩增目的基因。GAPDH的上游引物序列为5’-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3’，下游引物序列为5’-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3’；Ang II的上游引物序列为5’-GATGCCAGATACTGCGAA AGC-3’，下游引物序列为5’-CTTCCATTCGCACCACAGAC-3’；Bax的上游引物序列为5’-TGAACTGGACAACAACATGGAG-3’，下游引物序列为5’-AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACC-3’；Bcl-2的上游引物序列为5’-TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3’，下游引物序列为5’-TTCAGAGACAGCCAGGAGAAATC-3’。PCR条件为:95 ℃预变性1 min; 94 ℃变性15 s、58 ℃退火20 s、72 ℃延伸45 s，共40个循环; 72 ℃延伸7 min。以GAPDH为内参照，采用2-ΔΔCt法计算mRNA表达量。

3.7Western blot 检测肾脏组织Ang II、Bax和Bcl-2的蛋白表达 取部分冻存肾脏组织，液氮中碾碎，加入适量RIPA裂解液，提取总蛋白，采用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。取20 μg蛋白进行SDS-PAGE，并将蛋白转移至PVDF膜上，采用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入 I 抗 [anti-Ang II(1∶1 000)、 anti-Bax(1∶1 000)、 anti-Bcl-2(1∶1 000)和anti-GAPDH(1∶1 000)]置于4 ℃孵育过夜，洗涤后加入HRP标记的 II 抗山羊抗兔IgG(1∶10 000)室温孵育30 min，洗涤后滴加新鲜配制的显色液ECL，于全自动化学发光分析仪中曝光检测。

3.8TUNEL染色检测肾脏组织细胞凋亡情况 取大鼠肾脏组织蜡块进行切片，切片厚度为4 μm，65 ℃恒温烘干。经梯度酒精脱蜡至水，3% H2O2封闭30 min，PBS洗涤后经蛋白酶K消化液作用25 min，加入TUNEL反应液于37 ℃孵育60 min，加入过氧化物酶标记的抗荧光素抗体(Converter-POD)，置于湿盒内避光孵育30 min，PBS洗涤后DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树脂封片。光镜下观察染色结果，阳性染色为深褐色即为凋亡细胞。凋亡率以统计5个随机视野中阳性细胞百分比的均值表示。

4 统计学分析

运用统计分析软件SPSS 19.0进行数据分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 芪苈强心颗粒对CRS模型大鼠肾功能的影响

分别与2w sham和4w sham组比较，2w CRS组和4w CRS组大鼠血清Cre、血清Cys-C、UMA和尿NAGL含量显著升高(P<0.01)；与2w CRS组和4w CRS组比较，芪苈强心颗粒干预后的2w CRS-Q组和4w CRS-Q组大鼠血清Cre、血清Cys-C、UMA和尿NAGL含量均显著降低(P<0.05)；芪苈强心胶囊干预后的2w CRS-Q组Cre、Cys-C、UMA和NAGL水平均显著高于2w sham组(P<0.05)，而4w CRS-Q组仅Cre水平显著高于4w sham组(P<0.05)，其它指标的差异均无统计学显著性，见图1。

2 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠肾组织病理学的影响

光镜下观察HE染色结果显示，2w sham和4w sham组大鼠肾脏组织未见明显病理改变，肾小球和肾小管结构清晰，小管上皮细胞排列整齐；2w GRS组大鼠肾脏组织可见肾小管上皮细胞脱落、水肿和坏死，肾小管扩张，肾间质充血，4w GRS组大鼠肾脏组织损伤更加严重；芪苈强心胶囊干预2w CRS-Q和4w CRS-Q组大鼠肾脏组织损伤减轻，与2w和4w GRS组比较，2w和4w CRS-Q组肾小管上皮细胞脱落、水肿和坏死，肾小管扩张，肾间质充血等现象明显减轻，见图2。

Figure 1.The effects of Qiliqiangxin granule (Q) on serum Cre, serum Cys-C, UMA and urine NAGL in the rats with CRS. Mean±SD.n=15.*P<0.05,**P<0.01vssham groups;#P<0.05,##P<0.01vsCRS groups.

图1芪苈强心颗粒对CRS模型大鼠血清Cre、血清Cys-C、UMA和尿NAGL含量的影响

Figure 2.Observation of the pathological changes in the renal tissues of each group with HE staining (×200).

图2HE染色观察各组大鼠肾脏组织病理学变化

3 芪苈强心胶囊对CRS模型大鼠肾脏组织及血浆中Ang II水平的影响

分别与2w sham组和4w sham组比较，2w CRS组和4w CRS组大鼠血浆中Ang II含量显著升高(P<0.01)；药物干预2周和4周后，2w和4w CRS-Q组大鼠血浆Ang II含量较各自CRS组显著降低(P<0.05)，见图3A。且2w和4w CRS组大鼠肾脏组织中Ang II的mRNA和蛋白表达水平显著高于各sham组(P<0.05)，芪苈强心胶囊干预后，2w和4w CRS-Q组大鼠肾脏组织中Ang II的mRNA和蛋白表达水平则又显著低于2w和4w CRS组(P<0.05)，见图3B、C。

Figure 3.The effects of Qiliqiangxin granule (Q) on the levels of Ang II in plasma and renal tissues of rats with CRS. A: the serum level of Ang II in the rats was detected by ELISA; B: the mRNA level of Ang II in the renal tissues of the rats was determined by RT-qPCR; C: the protein level of Ang II in the renal tissues of the rats was evaluated by Western blot. Mean±SD.n=15.*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsCRS group.

图3芪苈强心颗粒对CRS模型大鼠血浆及肾脏组织中AngII水平的影响

4 芪苈强心颗粒对CRS模型大鼠肾脏组织细胞凋亡的影响

大鼠肾脏组织TUNEL染色结果显示,分别与2w和4w sham组比较，2w和4w CRS组大鼠肾脏组织细胞凋亡率显著上升(P<0.05)；分别与2w和4w CRS组比较，药物干预2周和4周后的2w和4w CRS组大鼠肾脏组织细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，见图4。

与2w和4w sham组比较，2w和4w CRS组大鼠肾脏组织中凋亡蛋白Bax表达显著增高，抗凋亡蛋白Bcl-2显著降低；与2w和4w CRS组比较，芪苈强心颗粒干预2周和4周的2w和4w CRS-Q组的Bax蛋白表达又显著降低，Bcl-2蛋白又显著升高(P<0.05)；同时，Bax和Bcl-2的mRNA表达水平与其蛋白表达水平趋势一致，见图5。

讨 论

根据心肾发病的先后和急慢，将CRS分成5个亚型：I型急性心肾综合征、Ⅱ型慢性心肾综合征、Ⅲ型急性肾心综合征、Ⅳ型慢性肾心综合征和Ⅴ型继发性心肾综合征[5]。急慢性CRS的发病机制有心输出量减少致肾脏血流灌注不足缺血缺氧、中心静脉压升高致肾静脉充血、内脏淤血水肿致腹内压增高，以及交感神经系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)激活释放血管活性物质等多种因素共同参与[6-7]。芪苈强心颗粒是一种传统中药复方制剂，具有益气温阳、活血通络和利水消肿功效。已有研究表明，芪苈强心颗粒可以通过抗氧化应激、抑制炎症反应和改善肾动脉血流等机制抑制大鼠心梗后心肾综合征病程进展[8]。也有研究表明，芪苈强心颗粒可以通过抑制RAAS系统的激活，改善慢性心力衰竭患者心功能[9]。然而，本研究通过构建急性CRS动物模型，证实芪苈强心颗粒可通过抑制肾组织细胞凋亡改善急性CRS大鼠肾功能，其机制可能与抑制RAAS系统的激活有关。

早期临床常使用血清Cre和UMA作为检测肾损伤的金标准，但受患者年龄、性别和肌肉质量等多因素影响并不能及时可靠地反映急性肾损伤[10]。Cys-C是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，在机体内的含量很稳定，且不受客观因素的影响。当肾小球受损时血液中Cys-C含量会突然增高，其灵敏度要比Cre高，是一种早期肾功能损伤的标志物[11]。NGAL是发现最早的肾小管损伤标志物，能在肾小管受损时迅速释放，可以在急性肾损伤后2 h内即可检测到，具有较高的特异性和敏感性[12]。已有研究证实，芪苈强心颗粒可改善CRS患者肾功能[13]。本研究联合血清Cre、血清Cys-C、UMA和尿NGAL等4个指标检测CRS大鼠肾损伤情况。结果显示，CRS组大鼠这4项检测指标在造模后2周和4周较sham组大鼠均出现显著升高，说明CRS组大鼠肾损伤严重；采用芪苈强心颗粒干预2周和4周后，发现CRS-Q组Cre、Cys-C、UMA和NGAL等4个肾损伤指标较CRS组显著下降。另外，肾组织病理染色结果也显示，造模后2周和4周CRS-Q组大鼠肾损伤情况均较CRS组轻，说明芪苈强心颗粒对CRS大鼠肾损伤具有改善作用。

Figure 4.Detection of the apoptosis in the renal tissues of each group by TUNEL staining (×200). The positive cells were stained brown. Mean±SD.n=15.*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsCRS group.

图4TUNEL染色检测大鼠肾脏组织细胞凋亡情况

Bcl-2家族对细胞凋亡的调控起着重要的作用，其家族成员中既可促进细胞凋亡(如Bax和Bid等)，又可抑制细胞凋亡(如Bcl-2和Bcl-x等)。细胞对凋亡信号的敏感取决于胞内Bcl-2/Bax竞争性的二聚体化过程，Bax同源二聚体的形成则可诱导细胞凋亡，与Bcl-2蛋白形成异二聚体则可抑制细胞凋亡[14]。急慢性CRS常因心输出量减少而导致肾脏血流灌注不足，缺血再灌注可造成肾脏组织缺血缺氧，并诱发肾脏细胞凋亡[15]。肖骏等[16]研究也发现苈强心胶囊可抑制心肌梗死后大鼠心肌细胞凋亡。本研究结果显示，造模后2周和4周与sham组比较，CRS组大鼠肾组织中Bax mRNA和蛋白水平均显著增高，而Bcl-2 mRNA和蛋白水平则显著降低；采用芪苈强心颗粒干预2周和4周后，CRS-Q组Bax mRNA和蛋白水平较CRS组显著降低，Bcl-2的mRNA和蛋白表达则较CRS组显著增高。TUNEL凋亡染色结果也显示，造模后2周和4周，CRS组大鼠肾脏组织细胞的凋亡率显著高于sham组，而CRS-Q组的凋亡率又显著低于CRS组。说明芪苈强心颗粒也可抑制CRS模型大鼠肾脏组织的细胞凋亡。

Figure 5.The effects of Qiliqiangxin granule (Q) on the mRNA (A) and protein (B) levels of Bax and Bcl-2 in renal tissues of rats with CRS. Mean±SD.n=15.*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsCRS group.

图5芪苈强心颗粒对CRS模型大鼠肾脏组织Bax和Bcl-2mRNA和蛋白表达的影响

Ang II是肾素-血管紧张素-醛固酮系统中的主要生物活性成分，除了具有调节血管张力并维持内环境稳定外，还参与了体内细胞生长、凋亡、氧化应激和神经炎症反应[17]。有研究表明，发生心力衰竭时心脏局部出现RAAS系统过度激活，从而导致心排血量减少，引起肾脏血流灌注不足，最终导致肾损伤[18]。本研究发现，造模后2周和4周与sham组比较，CRS组大鼠血浆Ang II含量显著升高，且使用芪苈强心颗粒干预后CRS-Q组血浆Ang II含量又显著降低，说明芪苈强心颗粒可抑制Ang II外分泌作用，从而减少由心排血量减少引起的肾损伤。另外，本研究还发现造模后2周和4周，CRS组大鼠肾脏组织中Ang II的mRNA和蛋白表达量显著高于sham组，苈强心颗粒干预后CRS-Q组Ang II的mRNA和蛋白表达量又显著降低，说明芪苈强心颗粒可抑制CRS大鼠肾脏中Ang II的表达。叶勇等[19]研究也证实，芪苈强心胶囊可以抑制心肌肥厚模型大鼠心肌组织中AngⅡ的表达；涂珊等[20]研究表明，外源AngII预处理可诱导肾小管上皮细胞凋亡；周安宇等[21]研究显示，抑制肾脏AngII表达可改善肾病综合征模型大鼠的肾功能。因此，芪苈强心颗粒抑制肾脏组织细胞凋亡改善CRS大鼠肾脏功能的机制可能与抑制Ang II表达有关。

综上所述，芪苈强心颗粒可以通过抑制肾组织细胞凋亡促进CRS模型大鼠肾功能恢复，其机制可能与抑制Ang II表达有关，这将成为我们下一步研究的重点。