莲藕资源耐盐性评价

周志疆，张 桢，蒋润枝，惠林冲，程立宝*

（1.江苏丰收大地种业发展有限公司，江苏 盐城 224000；2.扬州大学，江苏 扬州 225000）

莲藕是多年生宿根水生草本植物，因其丰富的营养成分和较高的保健作用，成为深受人们喜爱的水生蔬菜之一[1]。近几年，由于对莲藕加工产品的不断开发利用，莲藕已成为我国重要的出口创汇蔬菜之一[2]。荷花花色艳丽、香味高雅，是中国园林中重要的水景布置植物材料。莲因其药食兼用和观赏价值，深受广大人民喜爱[3]。

植物在受盐胁迫时，通过一系列的细胞渗透压和离子平衡途经降低或抵消盐分的伤害，以维持正常生长发育的行为称作植物的耐盐性[4]。目前，有关植物耐盐性鉴定和品种筛选的研究有很多。植物的耐盐性是植物体内一系列因素综合作用的结果，盐胁迫下，植物根系总吸收面积受到抑制，随着盐胁迫时间的不断增加，根系吸收能力持续下降，导致光合速率下降，植物叶绿素含量不断降低。正常生长状态下，植物活性氧的形成和消除处于动态平衡，植物遭受盐胁迫后，导致自由基积累，引起植物氧化损伤，但是超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等作为植物体内抗氧化酶系统的重要组成部分，能够有效加强活性氧清除能力，缓解盐对植物的伤害。根系活力、酶活性、叶绿素含量、质膜相对透性等生理指标均可以衡量植物受到盐胁迫后的伤害，这些单一生理指标存在差异性；所以，很难用单一的某个生理指标来评价植物的耐盐性。

近年来，不断恶化的土壤环境制约着农作物的生长发育，土壤盐渍化是土壤生产力发生劣变的常见现象，我国土壤盐渍化已经严重制约了农业的可持续发展。调查表明，在盐渍化较高的地区，通过栽培莲藕，既能取得一定的经济效益，又能达到以水洗盐、以水压盐的目的，同时改良土壤环境。到目前为止，国内外关于莲藕耐盐性状的研究较少，本试验通过综合评价筛选莲藕耐盐资源，以期为设施盐渍化土壤和沿海滩涂地区选育适合栽培的耐盐莲藕新品种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

以扬州大学园艺与植物保护学院水生蔬菜实验室保存的E1、E2、E3、E4、H2、H5、H8莲藕资源为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 试验方案

2017年5月，于扬州大学水生蔬菜试验基地防雨棚内准备长×宽×高分别为60 cm×40 cm×30 cm且铺2层0.08 mm厚的塑料薄膜的泡沫箱，每个泡沫箱中装土0.048 m3，种植4株种藕后装满水，每个莲藕资源种植9箱。种藕大小基本一致，且带顶芽。待莲藕匍匐茎长出7、8条时，倒出泡沫箱中的水，替换成浓度为0.6%NaCl溶液（通过多年的研究发现，NaCl浓度过低，处理后莲藕植株的表型变化不明显，浓度过高，植株全部死亡，0.6%NaCl溶液恰好能够区分莲藕的耐盐能力），体积为20 L，此后每天观察记录长势，第5天进行盐害指数调查，对照为等体积清水处理。为了进一步验证莲藕资源的耐盐特性，同样利用上述0.6%NaCl处理莲藕资源，在第5天对每个莲藕资源的叶和根进行随机取样，测定莲藕资源的质膜相对透性、丙二醛、SOD和POD活性、根系活力及叶绿素含量（重复3次），通过计算隶属函数值，区分莲藕不同资源的耐盐性。

1.2.2 测定指标及方法

1.2.2.1 不同莲藕资源盐害指数调查

利用0.6%NaCl处理莲藕资源，之后5d内，每天观察并统计莲藕叶片形状、颜色和受害症状。按照表1进行分级，然后根据如下公式计算盐害指数：

1.2.2.2 生理指标的测定

叶绿素含量的测定参照李合生等[6]的方法。称0.2 g研磨成粉的莲藕叶片，加入装有25 mL 95%乙醇的50 mL试管中，混匀后将试管放置于黑暗中2 h。652 nm波长下测定上清液的吸光值。试验均采取3次重复。公式如下：

式中V为提取液总量，W为叶片鲜质量。

丙二醛含量的测定参照李合生等[6]的方法。称取0.2 g在液氮状态下研磨成粉的莲藕叶片，加入2 mL 5%的三氯乙酸溶液后于震荡器上充分混匀，12 000 r/min离心20 min，提取上清液。吸取1.0 mL离心的上清液，加入1.0 mL 0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，混匀于沸水浴上反应10 min，迅速冷却后取上清液4 000 r/min离心10 min。于450 、532、600 nm波长下测定上清液吸光值。试验均采取3次重复。公式如下：

式中，VT为提取液体积，V1为测定用提取液体积，G为材料鲜质量。

SOD活性的测定参照张志良等[7]的方法。称取0.3 g在液氮状态下研磨成粉的莲藕叶片，加入2 mL磷酸缓冲液，缓冲液的pH值为7.8。12 000 r/min 4 ℃离心20 min，提取上清液，并于低温保存备用。在10 mL离心管中加入2 mL磷酸缓冲液、104 mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液0.5 mL、300 umol/L氮蓝四唑（NBT）溶液 1 mL、0.8 mol/L EDTA-2Na溶液0.5 mL、320 umol/L核黄素50 uL、上清液50 uL；对照管加磷酸缓冲液。混匀后将一支对照管置暗处作空白对照，利用4 000 lx的荧光灯照射其余各管30 min，待各管溶液颜色变黑褐后，用黑纸遮光终止反应。以不照光的对照管为空白对照，在560 nm波长下比色测OD值，试验均采取3次重复。公式如下：

式中，ACK为光照下对照管的吸光值；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积；VT为测定时样品用量；W为样品鲜质量。

POD活性的测定按表2加入各种试剂。在样品管中加10 uL 0.04 mol/L过氧化氢溶液，立刻摇匀，在470 nm处测OD值，读出第2分钟、第3分钟的OD值。公式如下：

式中，A470为反应期间某时刻的吸光度值；△A470为反应时间内吸光度值的变化；W为样品鲜质量；t为反应时间；VT为提取酶液总体积；Vs为酶液用量。

表1 莲藕盐处理后叶片受害分级

表2 各试管中需要加入试剂的量mL

根系活力测定参照张志良等[7]的方法。在称量皿中加入0.8 g莲藕根样品，加入10 mL 0.4%氯代三苯基四氮唑（TTC）溶液和磷酸缓冲液的等量混合液，让根充分浸没在溶液内，于37 ℃下暗保温2 h后再加入2 mL浓度为1 mol/L的硫酸，以停止反应。对照处理先加硫酸，后加样品，其他操作同上。在20 mL试管中加入吸干水分的根，并加10 mL甲醇，密封放于避光处静置2 h，待根变为白色时，在波长485 nm分光光度计下比色，以空白对照作参数测出吸光度，四氮唑还原量表示根系活力强弱，试验均采取3次重复。公式如下：

质膜相对透性参照张志良等[7]的方法。用无离子水洗净0.2 g鲜样叶片，剪碎放入已加入20 mL无离子水的50 mL试管，振荡30 min后于室温下静置30 min，用DDBJ-350型电导率仪测定溶液的电导率E1。然后将试管放置于沸水浴中10 min，冷却后测定溶液总电导率E2，以无离子水电导率E0为参照，按以下公式计算质膜相对透性（P），试验均采取3次重复。公式如下：

1.2.3 耐盐性综合评价

通过隶属函数分析法，在上述0.6%NaCl处理莲藕资源5 d内的生理指标（盐害指数、叶绿素含量、丙二醛含量、SOD活性、POD活性、根系活力及质膜相对透性）测定的基础上，全面评价了7种莲藕资源的耐盐特性。公式如下：

式中，X(μ1)和X（μ2）分别为正负相关指标的隶属函数值；X为上述指标测定值，Xmin为测定指标的最小值，Xmax为测定指标的最大值。

通过加权叶绿素含量、丙二醛含量、SOD活性、POD活性、根系活力及质膜相对透性指标的隶属函数值，最后计算出平均值，具体详见彭振等[8]方法。盐害指数隶属函数值为X（μ11），质膜相对透性隶属函数值为X（μ12），叶绿素含量隶属函数值为X（μ13），根系活力隶属函数值为X（μ14），过氧化物酶隶属函数为X（μ15），超氧化物歧化酶隶属函数为X（μ16），丙二醛隶属函数值为X（μ21）。

1.2.4 数据分析

试验数据均采用SPSS 16.0软件中One-Way ANOVA分析Duncan法（P＜0.05）进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同莲藕资源在NaCl处理下形态和生理指标的变化

2.1.1 不同莲藕资源在NaCl处理下的盐害指数

据观察，0.6%NaCl溶液处理2 d内，莲藕材料外观形态上没有发生明显盐害现象。由图1可知，处理5 d后，植株叶片开始萎蔫，表现出不同程度的盐害，其中H5、H8长势较好，受到盐害影响较轻，新叶能够正常展开；H2和E3受伤害程度最大，大部分叶片失水干枯、皱缩卷曲，新叶不能正常开展，畸形扭曲，叶片发黄，并生有黑斑。由图2可知，莲藕材料在0.6%NaCl溶液处理第5天，H2受到盐害影响程度最大，与其他莲藕材料的盐害指数有显著差异；E1、E2、E3、E4受到盐害影响程度处于中间值，而H5和H8受盐害影响程度比较低，其中H5莲藕材料盐害指数最低，说明盐胁迫下，H5耐盐能力最强，而H2耐盐能力最差。

2.1.2 不同莲藕资源在NaCl处理下的叶绿素含量

图3表明，各种莲藕材料在0.6%NaCl溶液处理后叶绿素含量存在差异，其中，E1含量最低，与其他材料叶绿素含量差异显著，表明耐盐性最低。H2和E3叶绿素含量相同，均为0.16%，差异不显著，且H2、E3和E1叶绿素含量均较低，表明H2、E3和E1受盐胁迫后导致光合作用下降，叶绿素含量减少严重。E2、E4、H5和H8叶绿素含量较高，表明耐盐性相对较强。

2.1.3 不同莲藕资源在NaCl处理下的质膜相对透性

由图4可知，0.6%NaCl溶液处理后H2质膜相对透性最高，高达45.01%，但与质膜相对透性为40.89%的E3差异不显著，显著高于其他莲藕资源，说明盐胁迫对H2和E3叶片伤害程度较大，H2和E3耐盐性较差；H8质膜相对透性最低，且与E1、H5差异不显著，说明这3种莲藕受到盐胁迫伤害相对较小，耐盐能力较高。

2.1.4 不同莲藕资源在NaCl处理下的根系活力

根系活力作为衡量根系抵御逆境能力的重要生理指标，能够反映出植株耐盐能力。由图5可知，莲藕材料受0.6%NaCl处理后H5的根系活力最高，为128.80 mg/（g·h），且与其他材料根系活力之间差异显著；E3根系活力最低，为34.76 mg/（g·h），但与莲藕材料E1、E2、E4、H2之间差异不显著；H8根系活力仅次于H5，但与H2之间差异不显著。

图1 NaCl处理对莲藕生长的影响

图2 不同莲藕资源在NaCl处理下的盐害指数

图3 不同莲藕资源在NaCl处理下的叶绿素含量

图4 不同莲藕资源在NaCl处理下的质膜相对透性

2.1.5 不同莲藕资源在NaCl处理下的丙二醛含量

丙二醛（MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤；因此，在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一个常用指标，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。图6表明，莲藕资源受盐胁迫后，E4的MDA含量最高，并且显著高于其他莲藕资源，说明E4受到的损伤最高，耐盐性最差；H5的MDA含量最低，但与其他莲藕材料MDA含量之间差异不显著。

2.1.6 不同莲藕资源在NaCl处理下的POD和SOD含量

图5 不同莲藕资源在NaCl处理下的根系活力

图6 不同莲藕资源在NaCl处理下的丙二醛含量

SOD、POD是重要的保护酶，可以有效地清除膜脂过氧化物对细胞造成的伤害。由图7可知，0.6%NaCl处理5 d后，E1、E3的POD活性较低，仅为60.93 、29.39 U/（g·min），二者之间差异不显著；H5的POD活性最高，为1 151.62 U/（g·min），但与POD活性为795.70 U/（g·min）的H8之间差异不显著。H5和H8与其他莲藕资源POD活性存在显著差异。由图8可知，E1的SOD活性最高，E1、H5、E2和H2的SOD活性差异不显著，但高于其他莲藕材料；莲藕材料E4的SOD活性最低。

2.2 莲藕资源耐盐性综合评价

采用隶属函数法对莲藕资源耐盐性进行分析，得到的单一指标的隶属函数值与最终的平均隶属函数值排序并不完全一致，说明单一指标不能准确反映出莲藕耐盐能力（表3）。7份莲藕资源耐盐能力差异明显，顺序依次是：H5＞H8＞E2＞E4（E1）＞E3＞H2。H5、H8品种耐盐能力相对较强，E1、E2、E4品种耐盐性相对中等，E3和H2品种耐盐性相对较弱。

3 结论与讨论

植物耐盐资源一般通过种子萌发期、苗期表现及产量进行筛选，需要综合评价植物全生育期生理数据和终产量才更可靠[9]。由于莲藕繁殖多为无性繁殖，且莲藕种子多为杂合，所以利用种子萌发期和最终产量评价试验莲藕资源难以实施，因此本试验在莲藕苗期进行了资源筛选。

图7 不同莲藕资源在NaCl处理下的POD活性

图8 不同莲藕资源在NaCl处理下的SOD活性

表3 莲藕资源耐盐性隶属函数与综合评判结果

熊雪等[10-11]研究不同紫花苜蓿品种在盐胁迫下的耐盐性，以电导率、丙二醛、叶绿素、脯氨酸含量、根系活力等作为耐盐性鉴定指标，再通过隶属函数法对6个紫花苜蓿品种在不同浓度盐胁迫下的耐盐性进行综合评价。本试验对莲藕材料的盐害指数、丙二醛、根系活力、叶绿素、细胞质膜相对透性和抗氧化酶等指标综合分析后，发现盐害指数大小与耐盐性综合评价基本一致，该指标可以作为莲藕耐盐性分析的重要单项指标之一。茄子在不同浓度盐胁迫下，随着胁迫浓度的增加，光合速率呈现下降趋势，叶绿体结构损伤引起非气孔限制[12]。用5种不同浓度NaCl处理辣椒发现与对照相比，随着NaCl浓度的增加，辣椒质膜系统受损，细胞质膜透性不断增加，电解质外渗，电导率升高[13]。本试验研究结果发现，莲藕材料受到盐胁迫后，H2和E1叶绿素含量最低，叶片受到的盐害最严重，生长发育受到抑制，这与前人研究结果基本一致；因此叶绿素和质膜相对透性可以作为鉴定植物耐盐性的指标。MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，是评价生物膜受损程度的一个重要指标。坛紫菜叶状体受不同浓度盐胁迫后，低浓度盐胁迫下坛紫菜叶状体的氧化损伤要显著高于高浓度盐胁迫，说明其含量与植物耐盐性呈负相关[14]。本试验中，莲藕受盐胁迫后，E4中MDA含量最高，与其他6个莲藕材料的MDA含量差异显著，而其他6个莲藕材料MDA含量差异不显著。邢建宏等[15]利用低中高3种不同的盐浓度处理秋茄根系，分析其根系活力，发现随着盐浓度的增加，秋茄根系活力呈现下降趋势，对秋茄的生长发育起到抑制作用。莲藕材料中H5根系活力最高，与其他根系活力有显著性差异，说明根系活力强弱可以体现植物的耐盐性强弱。

植物的生理生化和形态指标在受到盐胁迫后会发生一系列变化，通常单一指标难以准确反映植物耐盐性，但利用隶属函数法可以准确评价菊芋[16]、甜高粱[17]、茄子[18]和水稻[19]等植物的耐盐性。利用0.6%NaCl溶液处理后，莲藕资源的盐害指数、叶绿素、丙二醛、抗氧化酶活性及根系活力指标差异较大，其中E1叶绿素含量最低，说明E1受到的盐害最大，耐盐性最差；E4的MDA含量最高，并且显著高于其他莲藕资源，说明E4受到的损伤最高，耐盐性最差；E2受到盐胁迫后叶绿素含量最高，但MDA含量不是最高，表明单一指标难以准确评价莲藕材料的耐盐性。