循环肿瘤DNA在卵巢癌的应用进展

刘毓，刘斌，倾丽梅，刘翠萍，徐丽媛，杨永秀

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，可发生于任何年龄，早期几乎无症状，缺乏有效的诊断方法，大多就诊时已为晚期，而目前晚期卵巢癌并无有效的治疗手段。美国癌症协会最新数据统计显示，每年约2万卵巢癌新发病例，占女性恶性肿瘤的5%，约62%的病例死亡[1]，致死率居妇科肿瘤首位，因此早期诊断、疾病监测及个体化治疗对卵巢癌的预后具有重要意义。目前，用于卵巢癌检测的血清肿瘤标志物如糖类抗原 125（CA125）、人附睾蛋白 4（HE4）等因敏感度和特异度低而限制了临床应用，所以，需要寻找更准确的生物学指标。

1 循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）

循环游离 DNA（circulating free DNA，cfDNA）是循环体液中游离于细胞外的机体内源性DNA。凋亡、坏死或活跃细胞被巨噬细胞等吞噬消化后，释放出游离于血液的DNA，即cfDNA。其中一部分cfDNA来源于肿瘤细胞，释放肿瘤基因组DNA，称为ctDNA[2]。ctDNA是循环过程中脱落的微小cfDNA亚群，携带肿瘤的全部表观遗传特征，包含原发肿瘤DNA，也包含转移肿瘤DNA[3]，且其半衰期较短，能及时反映机体肿瘤情况。近年来，ctDNA在卵巢癌中的研究越来越多，已经成为卵巢癌诊断和治疗的研究热点。卵巢癌具有瘤内异质性和组织多样性，其ctDNA存在多种类型的DNA改变，包括异常突变、高甲基化、微卫星不稳定性（MSI）、杂合性缺失（LOH）等，ctDNA的这些改变与原发肿瘤病灶基因改变相同，利用这一特点，我们可以通过ctDNA为卵巢癌患者管理提供无创和敏感的技术方法，在卵巢癌的诊断、耐药性监测和预后评价中具有广阔的应用前景。

2 ctDNA检测方法

晚期卵巢癌患者的ctDNA信息容易获得，在血浆和腹水中的检出率达100%[4]，但早期患者ctDNA浓度较低，常呈高度碎片化状态[5]，检测困难限制了其临床应用。随着检测技术的发展，ctDNA的检测准确性有所提升。目前检测技术主要有富集聚合酶链反应（PCR）、数字 PCR（dPCR）和下一代测序（nextgeneration sequencing，NGS）技术[6]，3 种方法各有优点和局限性。富集PCR使用方便，结果准确可靠，但由于野生DNA扩增而限制其分析的敏感度，通常无法检测极低水平的ctDNA；dPCR应用广泛，有较高的敏感度和特异度，但需根据已知突变设计特定引物或探针，只局限于单个已知突变热点的研究；NGS技术可以快速、高效地检测体液中的基因突变，简便、创伤小、敏感度和特异度均较高，但扩增过程仍有可能引入错误基因的插入。除此之外，要实现ctDNA的临床应用，还需在样本采集、储存和检测方面做进一步规范。

NSG是一种新型高通量测序技术，促进了液体活检（liquid biopsy，LB）在实体肿瘤和无组织肿瘤中的快速应用[7]，为恶性肿瘤精准医疗提供了一个质的飞跃。Sato等[8]研究为减少NGS技术错误，提出基于NGS的分子条形码技术，在扩增前将分子条形码标记到ctDNA上，验证单个分子与原始序列的一致性，提高ctDNA的准确度和检测极限。有研究人员创造了基于Cas13的分子检测平台，即特异性高敏感度酶报告解锁（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking，SHERLOCK），在极低浓度下仍能检测核苷酸[9]。另一种基于CRISPR的方法称为DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告检测系统（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter，DETECTR）[6]，利用CRISPR/Cas9系统对野生PIK3CA基因的ctDNA片段进行剪切，并结合Cas12a作为敏感检测器，形成荧光报告基因，提高突变基因的检测敏感度[10]。由于克隆性造血（clonal hematopoiesis，CH，指造血干细胞维持自我更新的造血增殖行为）的存在可能使ctDNA检测产生假阳性结果，外周血细胞配对基因分型可以避免将CH衍生突变误诊为隐匿性恶性肿瘤，减少假阳性[11]。这些新型方法为ctDNA精准检测提供了新思路，可能比现有技术更快速、敏感，但要实现临床应用还需进一步研究。

3 ctDNA在卵巢癌诊疗中的应用

3.1 早期诊断与筛查卵巢深居盆腔，且为生殖器官，卵巢癌早期几乎无症状，大多就诊时已为晚期。早期5年存活率达90%，晚期5年存活率为27%[1]，所以早期诊断卵巢癌对患者的预后具有重要意义。当机体出现肿瘤时ctDNA水平显著升高，Gormally等[12]通过大型纵向前瞻性研究检测1 500名健康者外周血ctDNA突变基因，有33例受试者突变阳性，对突变阳性者密切随访，其中16例在平均18.3个月后发现恶性肿瘤，可见ctDNA突变可能是肿瘤发生的必要阶段。ctDNA在卵巢癌的诊断中具有重要的临床意义，在对1 005例肿瘤患者进行ctDNA评估时，卵巢癌的诊断敏感度达98%，结合循环蛋白检测后，卵巢癌的预测准确率为79%，二次重复预测准确率达92%[13]。对于卵巢癌这种隐匿性妇科恶性肿瘤，ctDNA的应用前景较为广阔。Shao等[14]研究选取36例卵巢癌患者以及41例卵巢良性肿瘤和健康人群，发现卵巢癌组血清cfDNA水平高于对照组（P＜0.01），良性肿瘤亚组与健康亚组间差异无统计学意义（P＞0.05）。而且，国际妇产科联盟（FIGO）Ⅲ、Ⅳ期患者cfDNA水平明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P＜0.01）。可见，ctDNA能早期诊断肿瘤并反映肿瘤负荷，如果再结合特异肿瘤标志物及影像学检查，实现肿瘤定位，其有望成为卵巢癌筛查项目之一。

ctDNA不仅可以定量检测，ctDNA突变基因检测也能实现肿瘤早期诊断。Phallen等[15]在68%的早期卵巢癌组织中检测出体细胞突变，与ctDNA突变高度一致[16]。有研究利用cfDNA完整性指数（即长cfDNA片段和短cfDNA片段的比值）进行肿瘤危险因素评估和分层[17]。Zhang等[18]研究检测48例卵巢癌、卵巢囊肿及健康女性血浆样本ALU重复序列的完整性指数，卵巢癌组ALU长片段和完整性指数明显高于对照组（P＜0.05）。ctDNA在侵袭性和转移性强的肿瘤类型中浓度较高，如高级别浆液性卵巢癌（HGSC）、结直肠癌和前列腺癌等。为了证实ctDNA在局限性卵巢癌中是否有应用价值，有研究检测成人型卵巢颗粒细胞瘤（AGCTs）中的ctDNA特异性突变基因。AGCTs是一种低度恶性肿瘤，进展缓慢，预后良好，但倾向于晚期复发，诊断时的期别是其重要的预后因素。Färkkilä等[19]对33例AGCTs患者血浆FOXL2基因进行检测，发现36%的患者突变阳性，初步证明ctDNA可用于AGCTs的诊断。

综上，通过ctDNA定量及特异性突变基因检测可实现卵巢癌的早期诊断并监测卵巢癌的发生，是一种快速、高效的非侵入性方法。除此之外，其还能克服取样困难情况下的肿瘤检测，作为卵巢癌的肿瘤标志物，成为LB的主要手段。

3.2 耐药性监测与指导用药化疗耐药是当前卵巢癌治疗面临的最主要问题之一。卵巢癌的主要治疗方法是手术，联合指南推荐的一线化疗方案卡铂+紫杉醇，但由于其有明显的组织学和分子学异质性，约50%患者复发，复发中位时间为16个月[20]，获得性耐药往往发生在疾病复发期，对于复发、铂耐药或铂抵抗患者的治疗较为复杂，整体预后较差。研究发现TP53突变、乳腺癌易感基因1/2（BRCA1/2）逆转突变是卵巢癌产生铂耐药的主要分子变化[21]，但卵巢癌的耐药基因及敏感基因检测受限于术后组织活检取样困难，耐药性监测需要一种有效的非侵入性方法。利用ctDNA可及时、非侵入性检测到耐药突变的发生，及时调整治疗方案，为寻找新的治疗靶点提供依据，推动靶向治疗进程。

25%的卵巢癌患者携带致病性BRCA1/2突变，且对聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（PARP1）抑制剂有良好的治疗反应。有研究者在31%铂耐药和铂抵抗的HGSC患者cfDNA中检测到BRCA逆转突变[22]。Christie等[23]对30例BRCA1/2种系突变的HGSC患者血浆标本进行检测，发现部分患者可检出BRCA1/2逆转突变，所有逆转突变的患者在后续治疗中都出现了铂类和PARP抑制剂耐药的情况，使用dPCR得到同样的结果[24]。可见BRCA逆转突变与卵巢癌耐药性的发生具有相关性，ctDNA能无创地检测出卵巢癌化疗药物耐药的逆转突变，及时了解机体的耐药情况。表观遗传学方面，检测卵巢癌患者ctDNA基因异常甲基化，可提前2年诊断卵巢癌，且能评估机体化疗后对铂类化疗药物的应答情况[25]。最新靶向治疗药物贝伐单抗和PARP抑制剂奥拉帕尼[26]，在BRCA突变（体系和胚系）及部分同源重组缺陷（HDR）患者体内可获得最大药物效用。美国食品药品监督管理局（FDA）批准奥拉帕尼用于BRCA胚系突变且既往至少经过3线化疗的复发性卵巢癌患者；卢卡帕利被批准用于BRCA突变且至少经过2线化疗的铂敏感或铂耐药性晚期卵巢癌患者。利用ctDNA检测BRCA突变为卵巢癌靶向药物的选择提供依据。

在卵巢癌耐药动物模型及细胞实验中，上皮-间质细胞转化（EMT）的相关基因与卵巢癌化疗药物顺铂的耐药性有一定相关性，且逆转EMT过程后，细胞的耐药性有所降低[3，27]。通过ctDNA检测患者血浆EMT相关基因突变，可以作为卵巢癌患者获得性耐药的监测手段，并指导靶向治疗。通过ctDNA动态监测药物靶向位点变化，实现靶向药物的用药指导，减少由于耐药而发生的治疗失败或疾病复发的情况，对患者制定个性化治疗方案，达到精准施药的效果，推进精准医学的前进与发展。

3.3 疗效预测与评估卵巢癌的治疗在化疗方案、敏感药物个体化选择方面仍有欠缺，治疗后需长期密切的监测与随访。卵巢癌残留病灶的检测是精准医学中的诊断难点和关键点，大多数患者即使行完全减瘤手术及规范性化疗后仍有很大可能复发。所以尽早发现微小病灶，检测残留和转移，既能提早干预临床复发及转移风险，又能避免术后治愈的患者接受过度的辅助治疗。

Balaji等[28]对包括卵巢癌在内的180例肿瘤患者的血浆样本进行分析，发现ctDNA能可靠监测肿瘤的特异性突变，高水平ctDNA与不良生存结局相关，无法检测的ctDNA与良好生存结局相关。1例术后诊断为ⅢC期浆液性乳头状卵巢癌的患者，基因检测时发现成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）阳性表达，在术后的治疗过程中，监测ctDNA中FGFR2融合表达后发现，ctDNA特异性融合与患者机体卵巢癌细胞的持续存在具有一致性[29]。在一项Meta分析中发现，cfDNA KRAS突变与卵巢癌总生存期（OS，P＜0.01）和无进展生存期（PFS，P＜0.01）较低有关，是患者生存预后的重要生物标记物[30]。Morikawa等[10]对29例卵巢透明细胞癌（OCCC）组织和cfDNA进行突变基因分析，5例OCCC组织及其中2例cfDNA PIK3CA突变阳性，3例OCCC组织及其中1例cfDNA KRAS突变阳性。随后监测阳性患者cfDNA水平变化，cfDNA突变升高早于临床发现疾病转移、复发和死亡，而CA125升高不明显且较慢。由此可见，根据患者ctDNA基线水平和卵巢癌的特异性突变基因检测，能有效预测卵巢癌患者的预后，实现患者管理。

BRCA1/2突变和TP53突变是卵巢癌常见的基因突变类型。BRCA1/2突变不仅与卵巢癌的化疗耐药具有相关性，还可以监测和评价患者预后。Ratajska等[31]检测121例卵巢癌患者肿瘤组织和ctDNA的BRCA1/2体细胞突变，两者具有一致性，ctDNA可以覆盖肿瘤组织中所有的BRCA1/2种系突变，且与突变阳性者相比，BRCA逆转突变阴性者PFS显著延长（P＜0.000 1）[22]。

90%以上的HGSC患者存在TP53突变。Kim等[32]检测HGSC组织和血浆TP53突变，符合率为100%。对突变基因进行等位基因计数（TP53MAC）后发现，ctDNA TP53突变含量与卵巢癌的手术减瘤程度呈正相关；化疗结束3个月后再次提取ctDNA，并根据ctDNA计数分为高TP53MAC组（≥0.2拷贝/L）和低TP53MAC组（＜0.2拷贝/L），高TP53MAC组患者的疾病进展时间（TTP）较低TP53MAC组明显缩短（P=0.038），TP53MAC与TTP具有相关性；治疗结束后ctDNA TP53监测比CA125更敏感地反应病灶残留与复发。Parkinson等[33]对318例卵巢癌患者治疗前ctDNA进行TP53MAC，发现TP53MAC与肿瘤大小呈正相关，引流癌性腹水后两者的相关性增强。化疗结束后再次检测TP53MAC，发现TP53MAC下降大于60%的患者对化疗较为敏感，TTP较长，具有较良好的预后。可见术后ctDNA检测可以对卵巢癌进行预后评价，并为术后残余病灶提供证据，早期识别高复发风险患者。

ctDNA作为表观遗传学变化的测量工具，卵巢癌异常甲基化特别是启动子/增强子异常甲基化是抑癌基因失活的重要机制。Thomsen等[20]用贝伐珠单抗联合生育三烯醇对23例晚期铂耐药卵巢癌患者进行临床试验，根据血浆HOXA9肿瘤特异性甲基化DNA（HOXA9-meth-ctDNA）水平对1个化疗周期后的患者进行分组，水平稳定或下降者中位PFS为7.8个月，中位OS为12个月；高HOXA9-methctDNA水平者中位PFS为1.4个月，中位OS为4.3个月，PFS及OS明显缩短（P＜0.05），而肿瘤组织中的突变未发现这一关联，提示ctDNA突变水平在治疗反应和预后评估中是极为敏感的。

BRCA1/2致病性突变与卵巢癌、输卵管癌和腹膜癌的发生显著相关[34]，有20%的卵巢癌存在BRCA1/2致病性突变。对于有卵巢癌家族史等高危人群，可以将ctDNA作为定期体检筛查手段，对于ctDNA阳性人群予以密切追踪，争取早期诊断与疾病干预，可适度降低卵巢癌高风险者预防性手术的实施，提高治愈率，改善患者预后。这些充分体现了ctDNA作为一种肿瘤特异性生物标记物在监测病情和疗效评价上具有明显优势。

4 结语与展望

目前ctDNA检测方法多样，缺乏标准化、样本收集不统一等问题很容易造成卵巢癌检测的假阳性结果，是目前面临的主要挑战。Merker等[35]和Diamandis等[36]认为，ctDNA在早期癌症诊断筛查、治疗监测和残留病灶检测中存在局限，不仅因为深度全基因组测序揭示突变能力有限，而且血液中提取ctDNA数量非常少，不太可能有效诊断癌症。Cohen等[13]在1 005例非转移性癌症患者中检测ctDNA，结合肿瘤标志物开发一项名为“CancerSEEK”的LB技术，卵巢癌的中位敏感度为70%，特异度为99%，但Ⅰ期卵巢癌的敏感度仅为43%，早期卵巢癌敏感度低限制了其在诊断中的应用价值。相对于其他实体肿瘤来说，卵巢癌的隐匿性使ctDNA比其他现有检测手段更有价值，所以ctDNA在卵巢癌中的应用值得推广。很多学者提出通过联合检测来提高敏感度，在CA125、HE4和超声成像基础上或阴道细胞涂片、子宫内膜细胞学基础上联合ctDNA，卵巢癌检测的敏感度从43%提高到63%[37]。

ctDNA作为LB技术，在非小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌的研究较为广泛，而在卵巢癌的研究较少，目前全球已有的141项ctDNA临床试验中妇科肿瘤仅20项[38]。ctDNA在卵巢癌应用中的无创性、可重复性和特异性受到了广泛认同，在卵巢癌的疾病诊断、预后评价和耐药性监测中具有重要的临床意义。未来，我们还需要通过大量研究寻找并筛选敏感度和特异度更高的分子指标，结合现有的分子指标进行联合检测，实现卵巢癌早期诊断，提供良好的治疗靶点，实现个体化治疗。