表皮生长因子协同体预处理对大鼠脑缺血再灌注的保护作用

渠静 许娜 奥婷 张君 张芹 肖淑英 张瑞华

[摘要] 目的 探讨表皮生长因子协同体（EGF-c）预处理对大鼠脑缺血再灌注（IR）的保护作用及其相关机制。 方法 将30只雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组（sham组）、缺血再灌注组（IR組）及EGF-c预处理+IR组（EGF-c组）。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞模型（MCAO）。术后24 h，应用2%氯代三苯基四氮唑（TTC）染色法检测脑梗死体积，酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测脑组织超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测高迁移率族蛋白1（HMGB1）的表达。 结果 与sham组比较，IR组脑梗死体积增大（P < 0.01），SOD活性降低（P < 0.01），MDA和HMGB1的含量增加（P < 0.01）。与IR组比较，EGF-c组脑梗死体积减小（P < 0.05），SOD活性上升（P < 0.01），MDA含量下降（P < 0.01），HMGB1的表达量下降（P < 0.05）。 结论 EGF-c预处理可能通过改善脑组织SOD活性、降低MDA含量、下调HMGB1的表达从而对大鼠IR起到保护作用。

[关键词] 表皮生长因子协同体;脑缺血再灌注;超氧化物歧化酶;丙二醛;高迁移率族蛋白1

[中图分类号] R743.31          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（b）-0008-05

[Abstract] Objective To study the effect of epidermal growth factor-coordination （EGF-c） on cerebral ischemia reperfusion （IR） in rats as well as its mechanism. Methods Thirty male SD rats were divided into sham group， ischemia reperfusion group （IR group）， EGF-c pretreatment and IR group （EGF-c group） by random number table method. The middle cerebral artery occlusion （MCAO） model of rats was made by suture method. 24 hours after operation， the cerebral infarction volume was detected by 2% triphenyl tetrazolium chloride （TTC） staining， the activity of superoxide dismutase （SOD） and the content of malondialdehyde （MDA） in brain tissue were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， the expression of high mobility group protein 1 （HMGB1） was examined by Western blot. Results Compared with sham group， the infarction volume was increased （P < 0.01）， the SOD activity was decreased （P < 0.01）， the contents of MDA and HMGB1 were increased in IR group （P < 0.01）. Compared with IR group， the infarction volume was decreased （P < 0.05）， SOD activity was increased （P < 0.01）， the content of MDA was decreased （P < 0.01）， the expression of HMGB1 was decreased in EGF-c group （P < 0.05）. Conclusion EGF-c pretreatment may play a protective effect on IR of rats by improving the SOD activity， decreasing the content of MDA and the expression of HMGB1.

[Key words] Epidermal growth factor-coordination; Cerebral ischemia reperfusion; Superoxide dismutase; Malondialdehyde; High mobility group protein 1

缺血性脑卒中呈现发病率高、致残率高和病死率高的特点，给社会和家庭带来了沉重的负担。近年来大量研究表明，自由基和炎性反应在缺血性脑卒中的病理过程中发挥重要的作用[1-4]。缺血性脑卒中的大鼠超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，丙二醛（MDA）和高迁移率族蛋白1（HMGB1）的表达升高[5-7]。目前，缺血性脑卒中的二级预防主要包括抗血小板和控制血压、血糖等危险因素，但此病的临床结局仍不理想[8-9]。因此，探索其他切实可行的干预措施是当前亟待解决的问题。表皮生长因子（EGF）是由53个氨基酸残基组成的小肽，可调节细胞生长、增殖和分化，近年来研究发现EGF在脑梗死后脑保护方面发挥积极作用[10-11]。肝素结合表皮生长因子是EGF家族成员，它可以减少MCAO大鼠的脑梗死体积，减少氧自由基以及氧化物的产生[12-14]。但EGF活性只能保持1周，从而为EGF的临床转化带来了困难。表皮生长因子协同体（EGF-c）是由毛叶绞股蓝萃取物与EGF融合而成，使EGF的活性保持时间显著延长，解决了EGF活性保持时间短这一难题[15]。EGF-c与EGF具有相同的生物学功能，因此本研究用EGF-c代替EGF，探讨其是否对大鼠IR有保护作用，并研究其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30只雄性SD大鼠，290～310 g，购自北京维通利华实验技术有限公司[SCXK（京）2009-003]。

1.2 仪器与试剂

倒置显微镜（Nikon公司，型号：ECLIPSE TS100）;台式低温离心机（Sigma公司，型号：3K15）;手术显微镜（Leica公司，型号：M525）;激光多普勒仪（Perimed公司，型号：PeriFlux 5000）;全自动酶标仪（美国Biotek公司，型号：ELx808）。

2%氯代三苯基四氮唑（TTC）染色液（北京索莱宝生物科技有限公司，批号：G3005）;大鼠SOD和MDA的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：m1540172、m1548189）;HMGB1兔单克隆抗体（美国abcam公司，批号：ab79823）;β-actin鼠单克隆抗体（北京冠星宇科技有限公司，批号：G1001）;二抗（北京索莱宝生物科技有限公司;批号：SE131、SE134）。

1.3 动物分组和模型的建立

将大鼠按随机数字表法分为三组：假手术组（sham组）、缺血再灌注组（IR组）和EGF-c预处理+IR组（EGF-c组）。EGF-c组于脑IR前连续每日腹腔注射EGF-c 20 μg/kg，共5 d。IR组和EGF-c组采用Zea-Longa法制备MCAO模型。手术过程如下：大鼠麻醉后仰卧位固定，行颈正中切口，分离肌肉及筋膜，暴露右侧颈总、颈外和颈内动脉。暂时夹闭颈内动脉，近心端结扎颈总和颈外动脉。在距颈总动脉分叉部4 mm处剪一小口，将栓线插到颈内动脉，当插入深度为18 mm时，系牢颈总动脉远心端的细线，缝合伤口。缺血2 h后将栓线拔出实现再灌注。造模成功标准[16]：术后12 h以Longa神经学评分在1～4分为造模成功。本研究通过首都医科大学附属北京潞河医院医学伦理委员会批准。

1.4 脑梗死体积的测定

IR 24 h后，麻醉大鼠，取脑组织并将其切成6个冠状切片，置于TTC溶液中染色，随后用4%多聚甲醛固定，用ImageJ 1.42软件加以分析。大脑梗死体积百分比由以下公式计算：梗死体积比=梗死体积/总体积×100%。

1.5 脑血流监测

大鼠麻醉后俯卧位固定，沿着头皮正中切开，用H2O2去除骨膜及颅骨表面的脂类，暴露前囟和颅骨。在前囟后2 mm、右侧旁开5 mm处，用颅骨钻将颅骨磨薄（不能钻透）。用激光多普勒仪监测血流。

1.6 SOD活性和MDA含量的测定

IR 24 h后，将大鼠麻醉后用生理盐水进行灌注，取其缺血侧脑组织，匀浆提取蛋白。根据实验说明书进行操作，酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测SOD活性和MDA含量，每个样本设3个复孔。

1.7 HMGB1蛋白的测定

取大鼠缺血侧脑组织匀浆提取蛋白，BCA法进行蛋白定量，每孔加入10 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将电泳物转置硝酸纤维膜上，脱脂奶粉室温封闭1 h，洗膜后进行一抗（抗HMGB1抗体1∶10 000;抗β-actin抗体1∶2000）于4℃过夜孵育，随后二抗（1∶10 000）于室温孵育1 h，自动曝光，使用ImageJ 1.42软件进行分析，结果以各目的蛋白与β-actin的灰度比值表示。

1.8 统计学方法

采用SPSS 18.0软件处理数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组脑梗死体积的比较

与sham组比较，IR组脑梗死体积增大（P < 0.01）;与IR组比较，EGF-c组脑梗死体积减小（P < 0.05）。

2.2 各组脑血流的比较

IR组与EGF-c组大鼠脑血流较sham组大，EGF-c组脑血流较IR组小，提示EGF-c预处理可以改善大鼠IR后的脑血流。

2.3 各组SOD活性以及MDA含量的比较

与sham组比较，IR组SOD活性显著降低，MDA含量显著升高（P < 0.01）;与IR组比较，EGF-c组SOD活性显著升高，MDA含量显著降低（P < 0.01）。

2.4 各组HMGB1含量的比较

与sham组比较，IR组HMGB1含量显著升高（P < 0.01）;与IR组比较，EGF-c组HMGB1含量降低（P < 0.05）。

3 讨论

研究表明，自由基在IR损伤的病理过程中发挥重要的作用。正常体内自由基生成与清除呈动态平衡，IR时生成大量的自由基，使脑内脂质过氧化作用加强，导致神经元坏死，加重脑组织水肿[17]。针对这一病理机制，寻找有效的自由基清除剂，阻止神经细胞毒性物质对神经元的损害，是实施脑保护治疗、改善IR预后的重要措施之一。本研究显示EGF-c预处理可以减少脑梗死體积，升高SOD活性，降低MDA含量，下调HMGB1的表达，从而对大鼠IR发挥保护作用。

IR损伤的机制较多，其中炎性反应是重要因素[18]。在炎性反应晚期，肿瘤坏死因子-α等细胞因子可促进HMGB1的释放，加重脑组织损伤[19]。研究发现，IR患者血浆中HMGB1表达明显高于正常人群，HMGB1的升高参与并扩大了炎性反应[19-25]。在自闭症儿童的血清中，EGF含量降低，HMGB1含量升高，二者呈负相关[26-29]。本研究发现IR组HMGB1的表达明显高于sham组，EGF-c组HMGB1的表达明显低于IR组，提示HMGB1参与了IR的过程，并且EGF-c可能通过降低HMGB1的释放从而减少IR后的损伤。

SOD是细胞内主要的自由基清除剂，能清除氧自由基从而抵抗其对细胞造成的损伤。MDA是细胞膜脂质氧化后的产物之一，其含量间接反映自由基含量及脂质过氧化程度。有研究表明，肝素结合表皮生长因子可以减少氧自由基及氧化物的产生[12-13]。本研究发现EGF-c预处理后SOD活性升高，MDA含量降低，提示EGF-c可能通过提高抗氧化酶活性，降低氧化应激产物，从而减少IR后的损伤。

综上所述，EGF-c能减轻脂质过氧化反应，提高SOD活性，降低MDA和HMGB1含量，对IR损伤具有明显的保护作用，在临床转化方面具有一定潜力。

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（收稿日期：2018-07-16  本文编辑：张瑜杰）