高效液相色谱法在兽用抗生素残留分析中的应用

程岁寒，潘存锋，张彦

(酵母功能湖北省重点实验室，宜昌 443003)

1 前言

抗生素(antibiotics)又称抗菌素，是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生物细胞发育功能的一种化学物质[1]。抗生素具有抑菌或杀菌作用，在禽畜养殖业中起着预防、治疗疾病，或促生长的作用，应用十分广泛。目前，世界上已知用于动物饲料的抗生素，有四环素类、磺胺类、大环内酯类、氨基糖苷类等，总数多达60多种[2]。然而这些抗生素，在禽畜体内并不能完全吸收或转化，大多直接以原形被排出[3-4]。有研究表明：随禽畜粪便排出体外的抗生素约＞30%，从而进入水体、土壤等周围环境中，成为重要的抗生素污染源[5]，而环境中的抗生素会通过食物链最终进入人体，或以畜禽肉类作食物，直接将残留的抗生素转移至人体内，最终导致人体产生抗药性，影响疾病治疗与康复[6]。因此，抗生素的限量使用和残留检测越来越受各国政府和学者们关注。目前，抗生素残留检测方法主要有色谱法、毛细管电泳法、微生物检测法、薄层层析法和免疫分析法等[7-9]，其中高效液相色谱(High-Performance LiquidChromatography，HPLC)是色谱法的一个分支，自上世纪60年代末逐步发展起来的一种分离分析技术，具备快速、高效、灵敏度高、自动化的特点，在抗生素的分析中应用广泛。随着色谱技术逐渐成熟，众学者更是将HPLC技术与各种高性能检测器联用，以实现同时检测多种抗生素或获得更低的检测限(LOD)。抗生素残留时往往配有紫外检测器(UV)、荧光检测器(FLD)、二级阵列检测器(DAD)以及质谱或者串联质谱检测器等。本文就高效液相色谱技术在兽用抗生素残留检测方面的研究进展进行综述。

2 高效液相色谱-紫外检测器

HPLC是目前在抗生素含量检测中应用较为普遍的技术，2015年版《中国药典》就有275种抗生素类药物使用HPLC进行检测，约占抗生素总收载数(493)的一半。根据抗生素药品的种类不同来选择流动相和紫外吸收波长，检测器大部分都是UV检测器[10]。抗生素的残留分析所涉及的样品复杂，检测需求持续增加，对建立快速、高效的分离方法的要求越来越高。因而对HPLC的分离性能提出了更高的要求。由于色谱柱是HPLC分离的核心，新型或高性能的色谱填料(又称为填充剂、固定相)的应用，为抗生素的检测提供了更多的选择。另一方面样品前处理也是抗生素残留分析的重要步骤，通过对样品前处理的优化可提高分析检测的灵敏性，特异性和准确度。抗生素残留检测时多使用液液萃取，固相萃取方法，固相微萃取等方法对样品进行除杂净化，因待检测样品和待测目标物的性质不同往往需要选用不同的前处理方法，如氨基糖苷类抗生素多数采用固相萃取法[11]。张志强等[12]在检测土壤和有机肥中3种四环素类抗生素残留时采用BondElut-SAX固相萃取小柱对样品进行提取净化，提取效率达到52%～95%，使用AgilentZORBAX SB C18的15cm短柱进行分析，大大缩短分析时间。徐少华[13]在检测鸡肉样品时利用亲水亲脂平衡柱(HLB柱)和羧酸根阳离子交换柱两种固相萃取小柱对样品进行固相萃取，发现提取、净化的效果较好，并使用Agilent SB C18色谱柱、紫外检测器同时对6种四环素残留进行分析，具有良好的精密度和准确度。对于抗生素的分离，色谱柱一般都选用C18反相色谱柱，对于分离效果不好的可选择其他填充物的色谱柱。蔡玉娥等[14]在分析尿液和牛奶中头孢类抗生素时，使用碳链较短的并嵌有的极性较大的磺酰胺基团的新型亲水性较强的C16硅胶色谱柱(4.6mm×150mm, 5μm)进行分离，紫外/可见光(UV/VIS) 检测器进行分析，检测限达5.60μg/L，回收率高。周殿芳等[15]等在检测鱼用饲料中8种常用磺胺类药物时，使用超高效液相色谱检测法(UPLC)，饲料经2%乙酸浸润，4℃预冷的乙腈提取，碱性氧化铝柱净化，用SymmetryC18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)进行分离，Symmetry C18柱采用waters的极性官能团嵌入技术，阻止了碱性化合物与硅胶表面残留硅羟基间的作用，对碱性化合物具有更短的保留时间，2%乙酸-甲醇梯度洗脱，紫外检测，8种磺胺类药物的平均回收率范围为70%～100%，该法简单、准确，可用于鱼用饲料中磺胺类药物残留的监测。

3 高效液相荧光检测器

高效液相色谱法-荧光检测器(HPLC-FLD )具有较高的灵敏度，具有荧光特性的抗生素可直接用HPLC-FLD检测。对于不具有荧光性或者荧光性差的抗生素，也可通过衍生化提高目标物的荧光性后进行检测[7]。如《GB29692-2013食品安全国家标准牛奶中喹诺酮类药物多残留的测定高效液相色谱法》中采用液相-荧光检测器检测牛奶中喹诺酮类药物残留[16]。吴海燕等[17]在检测水产品中鲤鱼、鳗鲡、对虾和海参中四环素、土霉素、金霉素和盐酸多西环素残留时同样使用HPLC-FLD法，样品溶液经HLB固相萃取柱进行除杂净化，再经C18反相色谱柱分离后用荧光检测器测定，方法定量限为达20μg/Kg，4种抗生素的回收率均在70.5%～100%。钱疆[18]建立了HPLC-FLD法检测乳制品中的9种氨基糖苷类抗生素残留的方法，样品用10%三氯乙酸提取，采用MCX固相萃取小柱净化，C18色谱分离，柱后用次氯酸钠溶液氧化，邻苯二醛(OPA)衍生，荧光检测。9种氨基糖苷类药物加标回收率在69.8%～110.2%之间。Irina等[19]用二氯甲烷和丙烯酸作萃取溶剂进行液-液萃取对样品进行提取纯化，并用液相色谱荧光检测器(HPLC-FLD)对鸡肉样品中氧氟沙星(OFLX)的含量进行测定，该方法简单易行有效。磺胺类化合(sulfanilamides)不具有荧光特性，常采用HPLC柱前或注后化学衍生法[20-23]。Huertas-Pérez等[24]用HPLCFLD法测定鸡肌肉和蛋类中8种磺胺类抗生素的含量时，将光化学反应器与色谱柱连接，磺胺类药物经紫外辐射发生光化学衍生反应，可增加荧光强度。该法回收率为65.9%～88.1%，灵敏度高，符合欧洲现行要求。许旭等[25]同样采用改良QuEChERS-高效液相色谱-光化学在线衍生荧光检测方法，对猪肉中18种磺胺类药物残留进行检测，该法前处理快速简便，选择性强。Du等[26]采用固相萃取结合高效液相色谱和荧光技术测定环境水样中的土霉素、四环素、强力霉素和氯四环素，检测限为51pg/mL～137pg/mL，回收率为78.1%～119.3%。

4 高效液相蒸发光检测器

蒸发光散射检测器(evaporative light-scattering detector，ELSD)是近年来发展的新型准质量型检测器，其响应不依赖于样品的光学性质，仅与样品的质量有关[27]。氨基糖苷类抗生素由氨基糖分子和非糖部分的苷元结合而成，种类结构类似，极性强，多易溶于水，水溶液中以多聚离子形式存在，性质稳定，多无发光团，没有特征的紫外吸收，难以选用紫外检测器检测，在2015版《中国药典》中，氨基糖苷类抗生素品种多采用蒸发光散射检测器测定含量、有关物质或组分，氨基糖苷类抗生素检测时，亲水性色谱条件检测效果更好，检测限更低。江勇等[28]将高效液相色谱仪与ELSD检测器联用，用C18柱实现了肉产品中3种四环素类抗生素和己烯雌酚的同时检测。Song等[29]建立了动物饲料中8种多肽类抗生素蒸发光散射检测器液相(HPLC-ELSD)检测法，样品经甲醇-2%甲酸溶液提取HLB固相萃取柱除杂，Phenomenex Kinetex苯基短柱(50mm×4.6mm,5μm)上分离出目标化合物，蒸发光检测器检测，回收率在72.0%～105.4%，成功地应用了该方法分析饲料中的多肽类抗生素。

5 高效液相-质谱检测器

在与HPLC 联用的各种检测器中，串联质谱(MS/MS)具有高灵敏度和高选择性的特点，抗干扰能力强，能够检测痕量药物残留，且可以实现多种化合物同时检测，在抗生素残留检测方面得到了广泛的应用[30]。李晓晶[31]等在检测土壤中兽用抗生素喹诺酮类、大环内酯类、林可霉素时，将超高效液相色谱与串联质谱进行联用(UPLC-MS/MS)，将分析时间缩短在7min内，实现了土壤样品中不同种类抗生素的快速、准确、灵敏的检测。国明[32]在检测环境水样时，在水样中，加入磁性材料进行固相萃取，然后用pH11的氨水水溶液洗脱后，经ZORBAX Eclipse PlusC18柱分离，用高效液相色谱-串联质谱在多反应监测(MRM)模式下同时进行检测6种四环素类抗生素，该方法灵敏度高、背景干扰低。Qin[33]开发了一种液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)方法检测动物样本中磺胺类、替米考星和阿维菌素残留量的方法，该方法使用超声辅助提取，正己烷除脂，和快速滤过净化柱除杂，C18色谱柱分离，经LC-MS/MS分析。所有抗生素的回收率在82%到107%之间。该方法成功地用于分析当地市场的动物样本的兽药残留。Chiesa[34]开发了一种HPLC-MS/MS方法，对42头猪的尿液和肉中残留的29种抗生素进行分析，发现尿液中抗生素检出频率与浓度要高于肌肉。李晓东等[35]建立了一种同时测定畜禽肉中18 种喹诺酮类兽药残留的方法，方法使用QuEChERS分散固相萃取试剂盒去除样品中极性有机酸、某些糖类、脂类等干扰杂质，采用C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)分离，以0.2%甲酸水溶液和0.2%甲酸乙腈溶液作为流动相进行梯度洗脱，UPLC-MS/MS多反应监测(MRM)模式下进行检测，18种喹诺酮类兽药的平均回收率在60.5%～97.0%。C18反相色谱柱在抗生素残留检测时较为常用，但对于某些样品，苯基柱、T3柱等其他反相色谱柱也是较好的选择。陈瑞春等[36]在检测牛奶和奶粉中9种青霉素类药物残留量时，样品经HLB固相萃取柱净化后，使用Thermo公司苯基柱分离，用高效液相色谱串联质谱检测，通过多反应监测(MRM)模式下进行地定性定量分析，具有更好的分离效果和准确度。吕佳等[37]建立饮用水中35种抗生素类药物的UPLC-MS-MS测定方法，采用HLB固相萃取柱对水样进行除杂，对抗生素进行富集，选择Acquity UPLC HSS T3色谱柱(2.1mm×100mm, 1.8μm)进行分离，质谱采用正离子扫描多反应监测(MRM)模式，结论该方法操作简单、快速，准确度和精密度均较高，适用于饮用水中35种抗生素的同时检测。BassSofia建立了一种同时测定欧洲鲈鱼中20种兽药残留的超高液相-四级杆飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)方法。样品经UPLCC18(50mm×2.1mm，1.7μm)分离，10min完成检测，抗生素回收率在93.8%到107.5%，检测限和定量限分别为2.22g/kg～15.00g/kg，6.67g/kg～45.46g/kg[38]。

6 小结

抗生素残留是影响动物性食品安全的重要因素之一，威胁着人们的生命安全，将高效液相色谱法应用于兽用抗生素残留的分析，可以较为精确地检测出水、土壤、各种畜禽以及畜禽衍生出来的食品中的抗生素种类和含量，对于环境中抗生素的迁移以及食品安全性评判发挥了巨大作用。从上述内容来看HPLC-UV、HPLC-FLD、HPLC-ELSD虽然是相对简单和便宜的选择，但他们的灵敏度略差于HPLC-MS/MS。而HPLC-MS/MS和UPLC-MS/MS虽然具有快速同时鉴别和检测各种试样中的抗多种生素种类和含量，具有更高的精密度和准确度，但是仪器成本高，对试剂和操作人员要求极高，因此很难用于大批量的检测，在多数基层食品安全检测部门使用仍然较难。在未来，抗生素残留检测更迫切地需要样品前处理简便、检出限低、选择性高、分析自动化程度高、周期短，以及高通量、多残留的样品分析方法。