肝癌免疫微环境及免疫治疗最新进展

何其宽，叶志宇，陈晓岗

（宁波市第一医院 普外科，浙江 宁波 315000）

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作为最常见的原发性肝癌（占70%～90%），据统计全球每年新增HCC至少有70万例[1]，仅我国就占到了其中一半。HCC主要的致病因素包括有：乙肝病毒、丙肝病毒、饮酒、糖尿病及一些代谢性疾病[2]。目前临床关于HCC的治疗选择，对于早期局部肝癌患者，可采用局部手术切除、肝移植、射频消融及经动脉化疗栓塞。由于早期无特异性表现，很多HCC患者在中晚期才能被确诊。而对于中晚期肝癌，通常采用全身药物治疗以寻求手术机会，最具代表性的是抑制血管生成的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）：索拉菲尼、乐伐替尼、瑞格非尼[3]。然而，由于药物耐受等原因，TKIs的治疗效果有限[4]。肝脏是机体最大的免疫器官，内部存在各种免疫细胞，HCC作为典型的炎症相关肿瘤，免疫耐受及逃避机制在癌症进展中发挥着重要作用[5]。在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中，癌细胞、细胞因子、免疫细胞、非肿瘤细胞和细胞外基质构成了一个动态系统，它们相互作用，产生生长因子、细胞因子和趋化因子来参与免疫抑制，从而促进肝癌细胞的进展[6]。其中，更有免疫抑制细胞通过分泌及信号转导作用进一步驱动免疫逃避。在本文中，我们将阐述肝癌相关免疫抑制成分及潜在的免疫治疗措施。

1 HCC肿瘤微环境中具有代表性的免疫抑制成分

1.1 骨髓来源抑制细胞（marrow-derived suppressor cells，MDSCs）

在HCC中，骨髓细胞分化为一组未成熟的髓样细胞，具有很强的免疫抑制活性并影响抗原呈递细胞功能[7]。MDSCs具有显著的多样性和可塑性，在不同环境中可以分化为巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等。MDSCs在肝癌TME中主要通过以下几个途径发挥免疫抑制作用：（1）诱导并扩增调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs），减轻效应T细胞功能；（2）抑制树突状细胞（dendritic cells，DCs）与自然杀伤细胞（natural killer，NK）极化状态，以及控制巨噬细胞向M2表型的转变；（3）消耗T细胞必需氨基酸，诱导其凋亡；（4）诱发氧化应激反应。肿瘤来源的细胞因子（如G-CSF、GM-CSF、VEGF、MCP-1、IL-1β等）可以进一步诱导MDSCs的浸润，其中肝脏内源性细胞周期相关激酶（cell cycle related kinase，CCRK）可以通过EZH2/NF-κB信号通路上调白介素6（IL-6）的产生[8]，诱导MDSCs在TME中聚集。同时，肿瘤细胞增殖期间造成局部缺氧状态，可以进一步促进MDSCs的积累，缺氧诱导因子1α（HIF-1α）被证实能够介导HCC细胞中CD39L1过表达以增加细胞外5’-AMP水平[9]，促进MDSCs进入TME。总之，由于MDSCs具有促进肿瘤及免疫抑制作用，可以将其作为HCC治疗的特异性靶点，并为缓解HCC进展提供可能的辅助疗法。

1.2 肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）

巨噬细胞起源于骨髓细胞来源的单核细胞，在不同环境刺激下巨噬细胞主要以M1和M2状态存在。有研究证实，交替激活状态的巨噬细胞可以刺激肿瘤的发生、发展及转移[10]。此外，作为骨髓来源细胞，TAMs可以通过分泌细胞因子和趋化因子，抑制肿瘤免疫能力并促进肿瘤进展。在HCC中，一些特异性免疫抑制TAMs已经成为近年来的研究热点。已知HCC来源的细胞因子如白介素4（IL-4）、白介素13（IL-13）、集落刺激因子1（CSF-1）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、结缔组织生长因子等可以诱导相关炎性单核细胞分化为TAMs，或者激活巨噬细胞浸润，进一步降低先天性免疫及后天适应性免疫。据报道，肝癌细胞可以分泌一种叫作骨桥蛋白的非胶原性骨基质糖蛋白，它与肝癌组织中PD-L1表达呈正相关，而且可以通过CSF1-CSF1受体途径促进肝癌中TAMs选择性活化以及趋化迁移[11]。MDSCs与TAMs之间相互作用可促进IL-10表达上升，IL-10作为一种强免疫抑制介质，能够抑制下游CD8+T细胞和NK细胞的细胞毒性作用。HCC中TAMs衍生的IL-10还可以增加肿瘤内Tregs的数量，从而抑制效应T细胞的活化。肝癌细胞周围基质中的巨噬细胞可以分泌多种炎症因子，其中IL-17可以介导CD4+T辅助细胞的扩增，后者可过表达多种肿瘤活化标志物来抑制抗肿瘤免疫作用[12]。TAMs还参与了其他免疫调节机制：转化生长因子-β可以活化HCC中的TAMs，活化的TAMs通过NF-κB信号通路激活下游IL-6表达，促进肿瘤生长和免疫耐受，而IL-6/STAT3信号通路还被证实可以促进肿瘤干细胞来进一步维持HCC的发生[13]。

1.3 肿瘤相关中性粒细胞（tumor associated neutrophils，TANs）

作为骨髓分化来源的又一类细胞，TANs与MDSCs、TAMs对HCC进展都具有促进作用。此外，TANs不仅能够促进肿瘤生长，还具有抗肿瘤生长作用。和巨噬细胞类似，TANs也可分为两个细胞亚型，即N1亚型（抗肿瘤型）和N2亚型（促肿瘤型），分别通过肿瘤信号转导通路来进一步发挥作用。TANs不同亚型的可塑性主要受转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的影响；TGF-β可以将TANs极化到N2表型，而抑制TGF-β与干扰素β（IFN-β）表达则可以诱导N1表型[14]。在肿瘤微环境中，TANs可以通过释放细胞生长因子来促进或者抑制肿瘤的发展。研究发现，HCC细胞及其TANs可激活患者外周血中性粒细胞，从而分泌细胞因子趋化因子配体2（CCL2）和趋化因子配体17（CCL17）。CCL2、CCL17与肿瘤大小、微血管浸润、肿瘤分化和分期等有关[15]。而且，CCL2和CCL17可以进一步促进HCC细胞、巨噬细胞和Tregs的迁移活性。综上，TANs可将巨噬细胞和Tregs细胞募集到肝癌细胞中，促进HCC生长和进展。

1.4 调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）

Tregs主要来源于外周T淋巴细胞、常驻T细胞以及其他细胞来源。Tregs不仅可以限制机体自身免疫反应，还可以抑制机体对微生物和病毒抗原、过敏原、肿瘤以及同种异体移植物的反应。T细胞受体与IL-10及TGF-β结合，激活信号通路活化Tregs。长链非编码RNA（lncRNAs）也对Tregs的激活起到关键作用，其中过表达的长链非编码表皮生长因子受体（lnc-EGFR）与EGFR结合后可阻止Tregs因泛素化作用而降解，从而促进Tregs在HCC中发挥免疫抑制作用[16]。在HCC患者中，Tregs的含量是显著上升的，其与肿瘤细胞的侵袭性密切相关[17]。因此可以推测，Tregs的水平与HCC的进展有关，并有可能成为HCC一个可靠的预测指标或免疫治疗的潜在靶点。

1.5 肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）

成纤维细胞与癌细胞之间的作用至关重要，它可以通过分泌各种生长因子及细胞因子来促进肿瘤的增殖、侵袭和远处转移；而这些与癌细胞相互联系的成纤维细胞被称之为CAFs。Kanto等[18]发现，骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）在HCC肿瘤微环境中作为CAFs的主要功能调节器之一，其内源性或外源性的产生都可以促进肝脏CAFs分泌细胞因子，增强肝癌细胞侵袭能力。HCC来源的成纤维细胞通过灭活NK细胞，使得NK细胞在TME处于无反应状态，从而为肝癌的进展提供了有利的条件。此外，CAFs还可以通过IL-6介导的STAT3信号通路激活并募集调节性DCs至TME中，而TME中分泌的TGF-β可以使其转化为免疫耐受型DCs，并进一步上调Tregs的产生[19]。总之，CAFs在HCC细胞的发生发展中起着重要的作用，靶向抑制CAFs也有望能有效缓解甚至阻止HCC的进程。

1.6 肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）

肿瘤中高密度的TILs被认为是机体对癌细胞免疫反应的结果。早期临床数据表明，肝癌患者术后高水平的淋巴细胞浸润，尤其是T细胞浸润可以有效降低复发率并提高患者生存率。但是，越来越多的证据证明，HCC患者中总的TILs浸润程度并不能有效提高自身免疫来控制肿瘤的进展。肝内免疫反应涉及到不同的淋巴细胞亚群，它们对HCC的免疫检测能力不同。其中最典型的就是Tregs与细胞毒性T细胞，两者之间的差异将决定TILs对HCC所起到的免疫作用[20]。

2 现阶段HCC免疫治疗策略

2.1 免疫节点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）

ICIs是一种特殊的膜结合分子，在肿瘤免疫逃避机制中起着重要的调节作用。在HCC中，最常见的ICIs包括程序性细胞死亡蛋白及其配体（PD-1，PD-L1）、细胞毒性T淋巴细胞蛋白4（CTLA-4）、淋巴细胞活化基因3蛋白（LAG-3）和含黏蛋白结构域分子3（Tim-3）。PD-1是调节CD4+、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞表达的调节性免疫球蛋白，在维持T淋巴细胞的免疫耐受和抑制免疫细胞活性中起重要作用。在HCC中，循环系统和肿瘤内PD-1+CD8+T细胞的增加预示着术后复发及不良预后，多种细胞因子尤其是IFN-γ诱导癌细胞PD-L1的上调进而削弱机体抗肿瘤免疫力，促进HCC进展[21]。现阶段临床研究的PD-1抑制剂纳武单抗（Nivolumab）、派姆单抗（Pembrolizumab）、度伐单抗（Durvalumab）在HCC中已被证实了有效的治疗作用。CTLA-4是一种活化的T细胞表达的抑制性共受体，主要存在于Tregs上，其在控制CD4+T细胞功能中起着关键作用。在HCC中，CTLA-4可以抑制肿瘤相关抗原识别和分化的T细胞增殖，通过诱导Tregs的活性和IL-10的产生进一步介导免疫抑制作用。目前，CTLA-4的特异性抑制剂替西木单抗（Tremelimumab）在改善HCC患者生存时间上有着明显的作用[22]。Tim-3是一种跨膜蛋白，可在分泌IFN-γ的Th1细胞、NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞上表达，它可与可溶性配体半乳糖凝集素9（Galectin-9）相互作用负性调节T细胞作用。LAG-3是免疫球蛋白超蛋白家族的成员之一，其以高亲和力和II类MHC分子结合，从而抑制T细胞的共刺激作用，来达到促癌作用。现阶段，有关Tim-3和LAG-3抑制剂在临床上的治疗价值还需要进一步阐明。

2.2 过继细胞疗法（adoptive cell transfer，ACT）

近年来，基于细胞的免疫疗法在实体肿瘤治疗中得到了一定的发展。其中，ACT为癌症治疗提供了有效而持久的抗肿瘤免疫能力。根据细胞类型，在HCC中使用的ACT疗法分为两种：一种是细胞因子诱导杀伤（cytokine-induced Killer，CIK）细胞疗法，另一种是嵌合抗原受体修饰的T细胞（CAR-T）疗法。CIK细胞是一系列T淋巴细胞的混合物，可以从外周单核细胞中获取，且容易培养。与细胞毒性T淋巴细胞相比，由于没有MHC限制，CIK细胞对肿瘤细胞具有更好的杀伤效果。CIK细胞还可以通过NKG2d配体相互作用，有效杀伤肿瘤干细胞，改善HCC患者生存时间。CIK细胞作为一种有效的ACT免疫疗法，为HCC的治疗提供了一种全新的选择。然而，部分接受治疗的患者存在“免疫疲劳”以及缺少足够白细胞的情况[23]，这也是CIK细胞治疗有待克服的一个缺陷。另一种ACT疗法，是基于CAR-T，其在HCC治疗中也具有一定疗效。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC-3）是一类在肝癌细胞膜上的癌胚蛋白多糖，可以促进HCC的进展，且与HCC不良预后有关。研究表明，细胞毒性T细胞活性与靶细胞中GPC-3的表达呈正相关[24]，靶向GPC-3的CAR-T细胞为GPC-3+的HCC提供了新的免疫干预措施。基于ACT的治疗为HCC的免疫治疗提供了新的途径。然而，在被广泛用作临床治疗药物前，它们在临床的疗效和肿瘤脱靶毒性仍需要进一步评估。

2.3 HCC非细胞免疫和溶瘤病毒免疫治疗

随着越来越多肿瘤相关抗原的鉴定，AFP、GPC-3、人端粒酶逆转录酶（hTERT）等多种肿瘤抗原已被确定为HCC免疫治疗的靶点。早期HCC-AFP疫苗在临床试验中可以检测到短暂的免疫作用；从TERT衍生而来的一种16个氨基酸组成的多肽疫苗（GV1001）[25]，它可以结合多个人类白细胞抗原复合物II分子，从而抑制肿瘤活性；GPC-3相关的疫苗可诱导HCC抗肿瘤作用，并延长患者总体生存时间。除了这些经典的肿瘤相关抗原外，还有一个潜在的新靶点即睾丸癌相关抗原（cancer-testis antigens，CTAs）[26]，由于CTAs在多种肿瘤和正常组织中的表达模式受到了一定的限制，它被认为是HCC免疫治疗的新靶点。溶瘤病毒可选择性地在肿瘤细胞中复制，杀伤肿瘤细胞并特异性地在肿瘤组织中传播，而不损伤正常细胞。对于HCC免疫治疗的溶瘤病毒，有报道多种治疗基因重组的溶瘤腺相关病毒（adenoassociated viruses，AAVs）可以在肝癌细胞中发挥特异性杀伤作用。另外还有一种重组的AAVs模型，即含有hTERT和TNF-α相关凋亡诱导配体基因的AAVs载体，它以肝癌细胞端粒酶为靶点发挥了特异的细胞毒性和凋亡作用，抑制HCC的生长。总的来说，非细胞疫苗及溶瘤病毒是有效的肿瘤治疗药物，这有助于进一步扩大HCC免疫治疗的选择。

3 结论

免疫耐受是导致HCC病死率居高不下、治疗效果不佳、预后差等不良后果的主要原因之一。在HCC中，包括MDSCs、TAMs、TANs、Tregs、CAFs和TILs等在内的免疫抑制细胞是TME的重要组成成分，它们与癌细胞、细胞外基质等共同组成了肿瘤微环境，从而抑制了免疫细胞的抗肿瘤活性，对促进HCC生长和侵袭也发挥着重要的作用。这些免疫细胞的分化、成熟及功能的发挥还受到细胞因子及其它化学因子的调节。因此，我们迫切需要开发针对这些免疫抑制细胞的治疗方法。本文也介绍了一系列相关的免疫疗法，包括ICIs、ACT疗法、非细胞免疫疗法和溶瘤病毒免疫疗法等。然而，很多免疫相关疗法尚处于试验阶段，仍需要进一步的临床验证。总的来说，免疫治疗有望成为治疗HCC最有前景的方法之一，随着不断的研究探索，我们相信免疫治疗还可以变得更加有效。