酶法辅助提取甘蔗渣中水溶性多糖的工艺优化

吴金松，陈光静，马志伟，陈晓培，刘俊桃，杨新玲，王保营*

(1.河南牧业经济学院，郑州 450046；2.西南大学 食品科学学院，重庆 400715)

甘蔗(Saccharumofficinarum)属草本植物禾本科，有薯蔗、糖杆、甜棒儿等别称，甘蔗秆直立高3～5 m，根状茎粗壮发达且多汁，是一年生或多年生的草本植物，普遍分布在热带和亚热带地域，在我国主要分布的两广、贵州等南方地区[1]。甘蔗中富含多种糖类、蛋白质、维生素(B1，B2，B6)、蔗脂、钙、磷、铁、植物甾醇、氨基酸等营养成分。由于甘蔗是生产食糖的主要原料，每年的制糖工业会产生大量的甘蔗废渣，如处理不当不但会引起资源浪费，同时也会造成环境污染。甘蔗渣中富含纤维素、半纤维素、木质素以及多糖、酚类等活性成分，其目前用途主要在燃料、造纸工业、木材、糖发酵、饲料、微生物培养基等方面，而关于甘蔗渣中活性多糖的提取纯化、活性研究报道较少[2-6]。赵毅[7]发现从甘蔗渣中以及制糖中提取出的糖蜜里，含有对小鼠艾氏癌和肉瘤-180有抑制作用的活性多糖物质。因此，探究甘蔗渣中的水溶性多糖提取工艺对于甘蔗渣资源的再利用具有重要意义。

活性多糖的分离提取工艺通常包括酸碱水解法、溶剂提取法、酶解法以及物理强化辅助提取法(超声波、微波辅助提取)等[8，9]。翁艳英等[10]在微波作用下对甘蔗渣粗多糖的提取进行探究，通过单因素和正交试验优化最佳的工艺条件，提取率为0.713%，相对较低；陈兴兴等[11]通过超声波提取法对甘蔗渣多糖的提取工艺进行研究，采用正交试验法优化研究多糖的提取，超声波提取法的原理是运用超声波在液体中产生的空化效应加快植物中有效成分的溶出，但是极易造成甘蔗渣大分子多糖结构的破坏。本文拟采用3种酶(中性蛋白酶、果胶酶和纤维素酶)辅助提取甘蔗渣中的粗多糖，从中筛选出最佳的一种酶，然后探索该酶的酶用量、酶解温度、酶解时间、酶解pH等因素对甘蔗渣粗多糖提取率的影响，采用正交试验优化，结合极差分析来确定较优的提取工艺条件，为工业化提取甘蔗渣多糖在功能食品、药品等领域的应用开发提供理论依据和数据参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

紫皮甘蔗：购于郑州市姚桥社区果蔬批发市场。

无水乙醇：新乡市三伟消毒制剂有限公司；葡萄糖标品：天津基准化学试剂有限公司；硫酸：洛阳昊华化学试剂有限公司；苯酚：天津市永大化学试剂有限公司；盐酸：开封市盛源化工有限公司； 果胶酶(≥30000 U/g，食品级)：上海士锋生物科技有限公司；纤维素酶(食品级，≥18000 U/g)：宁夏和氏璧生物技术公司；中性蛋白酶(食品级，≥18000 U/g)：南宁庞博生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

FA3204B分析天平(感量0.0001 g) 上海精科天美科学仪器有限公司；101-1型电热恒温鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；HH-2型电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；SHZ-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器有限公司；BJ-150多功能粉碎机 德清拜杰电器有限公司；Hanon i2可见光分光光度计 济南海能仪器股份有限公司；TU-1901双光束紫外可见光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酶法辅助提取甘蔗渣水溶性粗多糖的工艺流程

1.3.1.1 去皮、榨汁(收集甘蔗渣)、烘干、粉碎、过筛

先将新鲜的紫皮甘蔗刮去外皮(留皮会影响粉碎效果)，然后榨掉甘蔗汁，收集的甘蔗渣经90 ℃水漂烫后放入干燥箱中于60 ℃烘干，再用粉碎机将其粉碎，并过60目筛后，放置于密封袋中常温保存备用。

1.3.1.2 水提

将称好的甘蔗渣粉按照一定料液比加入烧杯中，放入恒温水浴锅中，在不同的酶解温度、酶解时间、酶解pH条件下浸提，酶解期间要用玻璃棒不断搅拌，避免甘蔗渣粉粘黏烧杯壁而影响浸提效果。

1.3.1.3 离心分离(或抽滤分离)

水提完成后，将其从水浴锅中取出冷却后分离上清液与沉淀物。再在同样的水提条件下将沉淀物重复浸提，过滤后丢弃沉淀物，将2次的上清液归并在一起。

1.3.1.4 上清液浓缩

用旋转蒸发仪(转速90 r/min，极限真空度0.1 MPa，55 ℃)或用蒸馏装置蒸馏浓缩，将上清液浓缩至剩余10～20 mL。

1.3.1.5 醇沉

将浓缩液缓慢加入，按一定比例与预冷4 ℃的无水乙醇混合(不同的乙醇终浓度)，然后放置于4 ℃的冰箱中静止12 h左右，会有白色物质从溶液中沉淀出来，将沉淀物与上清液抽滤分离，收集沉淀物，将沉淀物置于60 ℃的恒温干燥箱中干燥。

1.3.2 酶法辅助提取甘蔗渣粗多糖的单因素试验

参考相关文献[12,13]，影响酶法辅助提取甘蔗渣粗多糖的主要因素有酶用量、酶解温度、酶解时间、提取次数和乙醇醇沉浓度等。本试验以酶用量(%)、酶解温度(℃)、酶解pH和酶解时间(h)为单因素，探究其对甘蔗渣粗多糖提取率的影响。

1.3.2.1 不同酶在不同条件下的较优酶解条件

果胶酶的较优方案：酶解温度50 ℃、pH 5.0、时间40 min。

纤维素酶较优方案：酶解温度50 ℃、pH 5.0、时间35 min。

中性蛋白酶的较优方案：酶解温度50 ℃、pH 4.5、时间60 min。

参考相关文献[14]，通过试验比较，从上述3种酶中选出提取率较高的1种酶，然后用该酶进行下述的单因素试验。

1.3.2.2 不同酶添加量对甘蔗渣中粗多糖提取率的影响

通过改变不同的酶用量(1.0%～5.0%)，在固定条件(温度50 ℃，pH 5.0，时间40 min，酶解1次)下，依次试验，最后测定甘蔗渣粗多糖的提取率。

1.3.2.3 不同pH条件对甘蔗渣中粗多糖提取率的影响

通过改变不同的pH值(4.6～5.4)，在固定条件(酶添加量3%,温度50 ℃，时间40 min，酶解1次)下，依次试验，最后测定甘蔗渣粗多糖的提取率。

1.3.2.4 不同酶解温度对甘蔗渣粗多糖提取率的影响

通过改变不同的温度(40～60 ℃)，在固定条件(酶添加量3%，pH值为5.0下，时间40 min，酶解1次)下，最后测定甘蔗渣粗多糖的提取率。

1.3.2.5 不同酶解时间对甘蔗渣粗多糖提取率的影响

通过改变不同的酶解时间(20～60 min)，在固定条件(酶添加量3%，pH值5.0下，温度50 ℃，酶解1次)下，依次试验，最后测定甘蔗渣粗多糖的提取率。

1.3.3 酶法辅助提取甘蔗渣粗多糖的正交试验优化

为了确定酶法辅助提取甘蔗渣中粗多糖的最佳工艺条件，综合分析提取过程中各单因素对甘蔗渣粗多糖提取率影响的试验结果，固定酶解次数为1次，以酶用量(%)、酶解温度(℃)、以酶解pH和酶解时间(min)为正交试验考察的4个单因素，进行4因素3水平的正交试验设计L9(34)。试验具体安排和不同因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.3.4 甘蔗渣粗多糖提取率的测定

1.3.4.1 葡萄糖含量标准曲线的绘制

采用硫酸-苯酚法[15-19]。

取10 g左右的葡萄糖放置于105 ℃的干燥箱中烘至恒重，在干燥器中冷却后准确称量0.100 g，用蒸馏水溶解后定容到100 mL的棕色容量瓶中，配制成葡萄糖储备液(浓度为1.0 mg/mL)，从储备液中精确吸取5 mL于50 mL的容量棕色瓶中，加蒸馏水至定容刻度线，得到浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖供试液。再配制浓度为5%的无水苯酚溶液，用移液管精确移取50 mL苯酚溶液到1000 mL容量瓶中定容至刻度线，放入棕色瓶中避光保存备用。备好洁净、干燥的试管，用移液管分别准确移取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的0.1 mg/mL供试液至试管中，按顺序加入蒸馏水使总体积达到1.0 mL。再加入1 mL的5%苯酚溶液充分混匀后，迅速加入5 mL的浓硫酸，立即震荡混匀(做3组平行)，静止30 min。以空白试液(1 mL蒸馏水+1 mL 苯酚+5 mL浓硫酸)为参比，用可见光光度计于室温下测定490 nm处的吸光值。根据所测溶液的吸光值绘制标准曲线，再根据标准曲线绘制回归方程，进而计算出多糖水解液中的总糖含量(μg/mL)。

1.3.4.2 酶法辅助提取甘蔗渣粗多糖提取率

将抽提干燥过的甘蔗渣粗多糖沉淀物用蒸馏水溶解到250 mL容量瓶中，定容到标线后摇匀。然后用移液管分别精确吸取2 mL溶液，定容至50 mL的容量瓶中倒转晃动，使溶液混合均匀。然后从中量取1 mL甘蔗渣粗多糖溶液，依次加入1 mL的5%苯酚溶液混匀，迅速加入5 mL的浓硫酸，摇匀后静止30 min。以空白试液做参比，用可见光光度计于室温下测定490 nm处的吸光值。参照总糖含量标准曲线绘制方程，将吸光度值代入线性回归方程可计算出甘蔗渣粗多糖的浓度C。甘蔗渣粗多糖提取率的计算公式如下：

式中：C为样品葡萄糖浓度(μg/mL)；V为甘蔗渣粗多糖溶液总体积(mL)；D为稀释倍数；M为甘蔗粉质量(g)。

1.3.5 甘蔗渣粗多糖的紫外全波段扫描

取干燥后的甘蔗渣粗多糖，配制成0.5 mg/mL的粗多糖溶液，于紫外分光光度计上进行全波段扫描(190～400 nm)[20]。

1.3.6 试验数据分析方法

使用Origin 8.7和Excel进行图表的绘制，正交软件和SPSS 19.0软件进行相关数据的分析处理。

2 结果与分析

2.1 甘蔗渣粗多糖总糖含量标准曲线

图1 甘蔗渣粗多糖的标准曲线Fig.1 The standard curve of bagasse polysaccharides

按照葡萄糖浓度和测得的吸光度计算出线性回归方程为y=0.0093x+0.0149, R2=0.9995，总糖含量的标准曲线见图1。

2.2 不同酶对甘蔗渣粗多糖提取率的影响

图2 不同酶提取甘蔗渣粗多糖提取率Fig.2 The extraction rate of crude polysaccharides from bagasse with different enzymes

由图2可知，在推荐的较佳酶解条件下，纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶3种酶的提取率分别为0.877%，0.987%，0.843%，其中果胶酶的提取率最高，所以选择果胶酶进行后续的单因素和优化试验。

2.3 单因素试验对甘蔗渣粗多糖提取率的影响

2.3.1 不同酶添加量对甘蔗渣粗多糖提取率的影响

图3 不同酶添加量对甘蔗渣粗多糖提取率的影响Fig.3 Effect of different enzyme additive amount on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由图3可知，随着酶添加量的不断增加(1%～5%)，甘蔗渣粗多糖的提取率先增加后减小，在酶添加量为3%时提取率最高，酶的添加量过大会产生竞争性抑制反应，同时为后续的脱蛋白工艺增加难度，因此正交试验选择酶加量为2%～4% 三水平优化为宜。

2.3.2 不同酶解pH对甘蔗渣粗多糖提取率的影响

由图4可知，随着酶解pH值的增大(pH 4.6～5.4),甘蔗渣粗多糖的提取率先增大后减小，在pH 5.0时达到最大，可见果胶酶在pH 5.0时具有较高的活性，所以选择果胶酶pH 4.8～5.2 三水平进行正交试验优化为宜。

图4 不同酶解pH对甘蔗渣粗多糖提取率的影响Fig.4 Effect of different enzymatic pH on extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

2.3.3 不同酶解温度对甘蔗渣粗多糖提取率的影响

图5 不同酶解温度对甘蔗渣粗多糖提取率的影响Fig.5 Effect of enzymatic temperature on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由图5可知，随着酶解温度的不断升高，甘蔗渣粗多糖提取率呈现先上升后下降的趋势，50 ℃左右时提取率达到最大，由此可见一定的温度范围内，随着温度的增加，酶分子的活化能增加，从而加速反应。此外，蛋白酶也是蛋白质的一种，在高于最适温度的条件下会发生变性，因此温度对蛋白酶存在着激活与失活 。因此，选择果胶酶酶解温度45～55 ℃三水平进行正交试验优化为宜。

2.3.4 不同酶解时间对甘蔗渣粗多糖提取率的影响

图6 不同酶解时间对甘蔗渣粗多糖提取率的影响Fig.6 Effect of different enzymatic time on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由图6可知，随着酶解时间的增加，甘蔗渣中粗多糖的提取率不断增加，在20～40 min内提取率显著增加，在40～60 min内提取率增加不显著，考虑到提取效率，选择30～50 min进行后续的正交试验。

2.4 酶法辅助提取甘蔗渣粗多糖正交试验结果

正交试验优化酶法辅助提取甘蔗渣粗多糖的试验数据见表2，通过极差和极差分析(见表3)可知，4个单因素对结果的影响程度为B>D>A>C，即影响要素的主次关系排序为：酶解pH>酶用量>酶解温度>酶解时间，酶解时间对甘蔗渣粗多糖的影响不显著，综合考虑，得出最优组合为A2B2C1D3，即最佳酶解辅助提取条件为：酶解温度50 ℃，酶解pH 5.0，酶用量2.0%，酶解时间50 min。在此提取条件下做验证试验，甘蔗渣粗多糖的提取率为1.09%±0.011%，比推荐的较佳酶解条件提高了10.4%，达到了预期的优化效果。

表2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

注：F0.05(2,2)=19。

2.5 酶法辅助提取甘蔗渣粗多糖的紫外吸收曲线

图7 甘蔗渣粗多糖紫外扫描图谱Fig.7 Ultraviolet spectrum of crude polysaccharides from bagasse

由图7可知，酶法辅助提取甘蔗渣粗多糖溶液在波长190～400 nm范围内，经过紫外扫描后， 260 nm和280 nm 处均无明显吸收峰，说明不含或含有极少量的核酸和蛋白质等杂质。

3 结论

通过试验筛选出果胶酶作为甘蔗渣中水溶性粗多糖提取率最高的一种酶，对酶解条件进行单因素试验和正交试验优化，得到酶法辅助提取甘蔗渣中水溶性多糖的最佳工艺条件：酶解温度50 ℃，酶解pH 5.0，酶用量2.0%，酶解时间50 min。在此提取条件下做验证试验，甘蔗渣粗多糖的提取率为1.09%±0.011%，比推荐的较佳酶解条件提高了10.4%，达到了预期的优化效果。通过对酶法辅助提取到的甘蔗渣粗多糖溶液进行紫外扫描，在260～280 nm 处均无明显吸收峰，进一步说明了该提取工艺条件的可靠性。酶法辅助提取到的甘蔗渣粗多糖有待于进一步的纯化，为甘蔗渣多糖的活性探究和结构鉴定打了下坚实的基础。