宜昌地区结核分枝杆菌基因分型与成簇特征分析

刘晓俊 余枫华 余云芳 纪律 周攀 赵雁林

作者单位：443000 湖北省宜昌市疾病预防控制中心检验科(刘晓俊、余枫华、余云芳、纪律、周攀)；中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心国家结核病参比实验室(赵雁林)

肺结核是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病，又被称之为“贫困病”，多发于卫生条件差的贫困地区。据WHO报道2017年全球肺结核死亡患者达到160万例，其中HIV阴性肺结核患者死亡130万例，HIV阳性患者死亡30万例[1]。结核病仍然是全球头号传染病，严重威胁人类健康。我国结核病疫情存在高感染率、高复发率、高耐药率、低发现率的特点[2]。追踪传染源、搞清楚其传播途径、识别重点人群是结核病防控中重要的几个环节。随着近年来分子生物学的发展，特别是基因分型技术在分子流行病学中的应用，人们在应对传染病疫情时有更多快速可靠有效的找到传染源确定传播方式的方法。

结核分枝杆菌散在分布重复单位及可变数目串联重复序列(MIRU-VNTR)分型方法，由于其具有操作简单、重复性好、分辨率高且易于实验室间比对的特点[3-5]，被广泛应用于进行结核分枝杆菌基因分型的研究中。笔者以宜昌地区2016年12月至2017年5月收集的367株结核分枝杆菌临床分离株为研究对象，运用VNTR-MIRU技术对其进行基因分型，探讨菌株的遗传多样性、成簇性及传播率，为宜昌地区的结核病防治工作提供科学依据。

资料和方法

一、一般资料

2016年12月至2017年5月367株结核分枝杆菌临床分离株由宜昌市疾病预防控制中心分离获得，后送往中国疾病预防控制中心结核参比室代为传代培养、鉴定及保存。标准菌株H37Rv由中国疾病预防控制中心结核参比室提供。367株菌株分离来自367例患者，其中初治患者321例，复治患者46例。

二、实验方法

1. 主要试剂和仪器：2x Taq MasterMix (Dye)(北京康为世纪生物科技有限公司)、GoldenView(北京艾德莱生物科技有限公司)、引物(广州天一辉远基因科技有限公司)、DNA Maker(北京塞百盛基因科技有限公司)、琼脂糖(北京塞百盛基因科技有限公司)、电泳仪(美国Bio-Rad公司)、PCR扩增仪(杭州博日科技公司)、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

2. 位点选择:选择国际通用的24位点[6]VNTR-MIRU基因分型方法，引物由广州天一辉远基因科技有限公司合成。

3. 核酸的制备：将收集到的菌株接种于自制的罗氏培养基中，37 ℃培养2～4周，刮取1～2环结核分枝杆菌，置于装有500 μl TE的离心管中，涡旋混匀100 ℃金属浴30 min，灭活后将其超声裂解(300 W)，最后采用离心机16 200×g离心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱保存备用。

4. PCR扩增体系及条件：扩增反应在25 μl 体系中进行，其中12.5 μl 2× Taq Master Mix (Dye)，上游引物1 μl，下游引物1 μl，DNA模板1.5 μl，三蒸水补平至反应体积。PCR反应条件：(1) 94 ℃预变性2 min；(2) 94 ℃变性30 s，55～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；(3)72 ℃终延伸10 min；(4) 4 ℃保存。

5. 电泳检测：取8 μl扩增好的PCR产物，按照电场强度8 V/cm设置电压，在2%的琼脂糖凝胶上电泳30 min.，在紫外凝胶成像系统下观察结果，以DNA Marker为参照记录片段的大小(bp数)。

6. 成簇性分析：将扩增到的片段数字化，每个位点的拷贝数等于产物长度减去侧翼序列的长度，然后除以单个重复单元的序列长度，得到重复拷贝数。2株或者2株以上的结核分枝杆菌如果所有位点的拷贝数都一致，就认为形成了1个簇，成簇率计算公式为：nc/n；传播率计算公式为[21]：(nc-c)/n×100%；其中c为簇数目，nc代表成簇的菌株总数，n代表总菌株数。将每一株结核分枝杆菌分离株在相应的位点拷贝数记录下来，导入到BioNumerics 5.0软件，进行成簇性分析。

7. 位点评价：用Excel处理和分析数据。位点的遗传差异性值h由下面公式计算获得[7]：

其中xi为某一特定基因的频率，n为总分离株数。

总分辨率和各点的分辨率：用Hunter-Gaston指数(HGI)来衡量，其计算公式如下[8]：

其中，n为总的菌株数，s为获得的基因型总数，nj为某基因型的菌株数。

三、统计学处理

组间计数资料的比较采用χ2检验。所有假设检验均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、PCR扩增情况

对367株结核分枝杆菌采用24位点的VNTR-MIRU位点重复序列的PCR扩增，采用24个位点的重复序列进行PCR扩增，得到了24位点完整的琼脂糖凝胶电泳结果(图1)，通过判读电泳条带的大小，计算每个位点的重复拷贝数以获取基因分型的数据。

不同菌株在同一位点上的拷贝数(表1)差异提示该位点的遗传多样性大小。在同一位点的不同拷贝数越多，表明该位点的等位基因表现了很强的差异性。如分析QUB11b这个位点，就发现它有1、2、3、4、5、6、7、9共计8个不同类型的拷贝数；而有的位点如MIRU24，仅仅只有1个类型的拷贝数，表明其遗传多样性小。

二、遗传多样性及分辨率

24位点的MIRU-VNTR检测结果表现出了明显的遗传多样性(表2)，各个位点的等位基因的多态性(h值)在0.03～0.79间变化，最小的MIRU24为0.03，最大的QUB11b为0.79。

24个组合位点的结核分枝杆菌的总分辨率(HGI值)为0.999，计算各位点的HGI值的大小顺位为：QUB11b=Mtub21>MIRU26>Mtub04>QUB26>MIRU31>QUB4156>MIRU40=MIRU10>ETRA=MIRU39>MIRU16>Mtub30>MIRU04>ETRB>MIRU27>Mtub39>MIRU23>ETRC>MIRU02>MIRU24。其中分辨率大于0.6的高分辨位点[9]有5个，分别为QUB11B、Mtub21、MIRU26、Mtub04及QUB26；分辨率在0.3～0.6之间的中分辨率位点有6个，小于0.3的低分辨率位点13个。

表1 367株结核分枝杆菌24位点VNTR重复拷贝数分布(株)

注 图1a M为Marker Ⅱ，2泳道为H37Rv阳性对照，3～10泳道为部分结核分枝杆菌在ETRC位点上的PCR产物；图1b M为Marker Ⅱ，2泳道为H37Rv阳性对照，3-10泳道为部分结核分枝杆菌在QUB11b位点上的PCR产物；图1c M为Marker Ⅱ，2泳道为H37Rv阳性对照，3～9泳道为部分结核分枝杆菌在MIRU02位点上的PCR产物；图1d M为Marker Ⅱ，2泳道为H37Rv阳性对照，3～9泳道为部分结核分枝杆菌在MIRU27位点上的PCR产物图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

表2 24位点的多态性及分辨率

续表2

图2 367株结核分枝杆菌株聚类分析图

三、指纹图谱

对367株结核分枝杆菌采用MIRU-VNTR检测的结果进行聚类分析，发现其基因型呈明显的多态性(图2)，总共有324个基因型。成簇性分析发现其中90株菌株形成39个簇，成簇率为24.52%，而未成簇仅形成“唯一”类别的共计285株。在成簇菌株中(图3)，分别有2株成簇、3株成簇、4株成簇、5株成簇等4种类型；其中最大的簇为5株成簇，成簇率为5.56%。根据传播率计算公式计算出367例患者的近期传播率为13.90%(51/367)。

图3 90例成簇菌株成簇株数分布

四、成簇型和独特型结核分枝杆菌与初治、复治患者的相关性分析

本研究将367株结核分枝杆菌分为成簇型和唯一型，分别为90株(24.52%，90/367)和277株。其中复治患者46株，成簇型10株，成簇率(21.74%，10/46)；初治患者321株，成簇型80株，成簇率(24.92%，80/321)。经χ2检验，成簇菌株和独特型菌株在初治患者和复治患者中差异无统计学意义(表3)。

讨 论

随着近些年分子生物学的飞速发展，分子流行病学在结核病的应用也越来越广泛，比如结核病的暴发和流行、传染源的寻找和追踪、内源性复燃和近期外源性感染的鉴别，以及耐药菌株的传播和实验室污染等。结核病分子分型常用的方法包括IS6110限制性片段长度多态性(IS6110-RFLP)、间隔寡核苷酸分型(Spoligotyping)、VNTR-MIRU，以及最近发展起来的二代全基因组测序(WGS)等。这些分型方法通常以IS6110-RFLP为金标准[10]。IS6110-RFLP由于其具有分辨率高、可比性好的特点，自从1993年以来已被广泛应用在结核分枝杆菌分子分型当中；但是IS6110-RFLP的缺点同样明显：对实验室技术能力要求较高、费用较大、耗时较长、菌株量要求大，且不同实验室做出来的数据较难进行比较等。Spoligotyping与IS6110-RFLP比较，虽然有耗时短、所需要DNA量小、且实验室间比对容易等优点，但是其分辨率却不理想，较IS6110-RFLP差；且对于某些广泛流行的菌株，特别是在我国乃至全世界流行的北京家族株的分型能力较差[11]。WGS是一种最新的基因分型方法，它相对于传统的分型方法具有高通量、高效率且能发现传统成簇菌株之间的差异、分成更小的簇，以及准确鉴别传播发生的路径顺序和是否存在多个传染源等优点；虽然随着二代测序的发展，WGS较一代成本已经明显下降，但是相对于传统分子分型方法成本还是要高很多，且数据分析处理较为复杂，需要较强的数据处理能力[12-13]。VNTR-MIRU是一种利用PCR方法扩增结核分枝杆菌卫星DNA侧翼序列间重复拷贝单元，然后对拷贝数进行数字化编码，再通过相关软件对这一串数字编码进行分析然后得到相应分型结果的过程。其操作简单、成本低、重复性好，且所得结果可比性好，分辨率与IS6110-RFLP几乎相当，因此被美国疾病预防控制中心推荐为结核分枝杆菌分型的首选方法[14]。van Dentekom等[15]认为，在分析近期结核分枝杆菌传播时MIRU-VNTR比IS6110-RFLP更合适。

表3 初治与复治患者菌株成簇率比较

注“成簇菌株数”小括号内数值为“成簇率(%)”

VNTR-MIRU目前已经发现了可以被选择的多个多态性位点，不同的位点分辨率差异较大，且同一位点在不同的研究中分辨率差异也较大，因此选择合适的位点组合对于进行更好的基因分型至关重要。世界各地的学者都在探索最优的位点组合，常见的位点组合有12位点、15位点和24位点。通常认为15位点和24位点的组合更接近IS6110-RFLP的分辨率[16]。本研究选用国际上通用的24位点进行VNTR-MIRU分型。结果提示24位点的HGI达到0.99997，分型效果较好。各位点的分辨率不同，HGI变化范围为0.03～0.73，其中QUB11B、Mtub21、MIRU26、Mtub04、QUB26 等5个位点的分辨率较高，提示位点的进化较快、多态性高，这与陈志等[17]对四川省绵阳地区结核分枝杆菌基因分型的结果基本一致。

此次研究对宜昌地区367株结核分枝杆菌临床分离株进行分析，发现其共有324个基因型，呈现出较高的遗传多样性。成簇性分析得到其成簇率为24.52%，低于西班牙、英国等国家报道的(36.6%～54%)成簇率[18-19]，与2014年徐贵生[20]调查的江苏连云港地区的19.54%成簇率较为接近。本研究对初、复治患者进行了与成簇率相关性的比较，结果表明宜昌地区成簇型和独特型菌株在初治和复治患者之间差异无统计学意义，提示近期传播致病的传播率初治和复治患者相当，该结果与张志等[21]对邢台地区结核分枝杆菌复治患者的成簇率显著高于初治患者的成簇率的结果不一致；笔者分析这可能与本次研究收集的菌株数量不够大、时间比较集中，且无法拿到复治患者初次发病时的痰液标本有关。 笔者认为，结核分枝杆菌成簇率可反应该地区的近期流行情况，成簇率越高提示近期流行较高，反之非成簇患者则可能为既往感染的内因复燃所致。本研究表明，宜昌地区结核病患者以既往感染的内因复燃为主，致病病原间有较高的遗传多样性；同时又提示存在一定的成簇比例，而成簇率与传播率相关。本次研究中近期传播率为13.90%，提示本地区存在结核分枝杆菌近期传播风险，应当在结核病防治过程中加强监测。