健脑益神丸质量标准研究

刘珊 苗立成 牟立娜 孟繁颖 侯明月

[摘要] 目的 建立健脑益神丸的质量标准。 方法 对健脑益神丸中的炙甘草、葛根、酸枣仁、益智仁进行显微鉴别，对川芎、葛根采用薄层色谱法（TLC）进行定性鉴别，并采用高效液相色谱法测定健脑益神丸中葛根素的含量，色谱柱为美国Agilent Zorbax Extend-C18，柱温为室温，流动相为甲醇-水（25∶75），流速为1.0 mL/min，检测波长为250 nm，进样量10 μL。 结果 该制剂的显微鉴别明显;TCL斑点清晰，阴性样品无干扰;葛根素在40～240 μg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系（r = 0.999），平均回收率为99.98%，RSD为0.44%。 结论 该方法稳定、可行，且专属性高，可有效控制健脑益神丸的质量。

[关键词] 健脑益神丸;质量标准;显微鉴别;薄层色谱;葛根素

[中图分类号] R286.0          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（a）-0024-05

健脑益神丸（原名益智养神健脑丸）[沈制字（2011）F10053]为解放军第二一一医院自制制剂，主要由党参、益智、巴戟天、炒酸枣仁、防风等中药组成。具有滋阴补髓、开窍益脑的功效，治疗脑疲劳具有良好的效果[1-2]。原有质量标准只有对党参、防风进行薄层鉴别。为严格控制制剂质量，本研究拟对制剂中的炙甘草、葛根、酸枣仁、益智仁进行显微鉴别，并参考相关文献[3-14]，采用薄层色谱法（TLC）对川芎、葛根进行定性鉴别，建立健脑益神丸中有效成分葛根素的含量测定方法，以期提高健脑益神丸质量的可控性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

紫外透射反射分析仪（上海康华生化仪器制造有限公司）;Nikon YS 100显微镜 [南京江南光电（集团）股份有限公司];电子天平（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）;BSA2245电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）;08A1608040薄层色谱点样仪（上海科哲生化有限公司）;Waters 2489型高效液相色谱仪配Waters 2487型紫外检测器（美国Waters公司）;UV-1601PC可见紫外光谱扫描仪（日本岛津）。

1.2 试药

葛根素对照品（批号：752-9002，HPLC≥99%）购于中国药品生物制品检定所;川芎对照药材购于福建孟氏药业有限公司（批号：20150601，20150704）;健脑益神丸由解放军第二一一医院制剂室提供（批号：20151001，20151002，20151003，20151101，20151102，20151103）。

甲醇为色谱纯（美国ACS公司），其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2方法与结果

2.1 显微鉴别

取数丸健脑益神丸，置研钵中，研碎，再取其粉末适量，置于显微镜下进行显微鉴别。

炙甘草：纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维。葛根：纤维成束，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞的壁木化增厚。酸枣仁：内种皮细胞棕黄色，表面观多角形或类方形，垂周壁连珠状增厚。益智仁：色素层细胞含红棕色或深棕色，皱缩，界限不清楚，常碎裂成不规则色素块。见图1。

2.2 薄层鉴别

2.2.1 川芎的薄层鉴别  取健脑益神丸10 g，研碎，加乙醚20 mL，超声处理30 min，滤过，滤渣挥干，备用。滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即为供试品溶液。另取川芎对照药材1 g，按上述方法制成对照品溶液。照薄层色谱法试验[15]，吸取對照药材溶液和供试品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。在与对照药材色谱相同的位置上，供试品显相同颜色的荧光斑点;阴性样品色在相同位置上无干扰。见图2。

2.2.2 葛根  取“2.2.1”项下的备用滤渣，挥干乙醚，加甲醇20 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取葛根素对照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg葛根素的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验[15]，吸取供试品溶液和对照品溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。在与对照品色谱相同的位置上，供试品显相同颜色的荧光斑点;阴性样品在相同位置上无干扰。见图3。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件  色谱柱为Agilent Zorbax Extend-C18（4.6 mm×250 mm）;柱温为室温;流动相为甲醇-水（25∶75）;流速为1.0 mL/min;检测波长250 nm;进样量为10 μL。理论板数按葛根素峰计应不低于2000。

2.3.2 对照品溶液制备  取葛根素对照品精密称取适量，加30%乙醇制成每1 mL约含0.1 mg葛根素的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液制备  取健脑益神丸水丸适量，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入乙醚20 mL，超声处理（功率180 W，频率50 kHz）20 min，放冷，滤过，弃滤液，滤渣蒸干，加30%乙醇60 mL，摇匀，密塞，称定重量，超声25 min，冷却，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 阴性样品溶液制备  按制备工艺处方1/100取除葛根外其余所有药材，按照制备工艺制备，制成葛根阴性样品;按照“2.3.3”供试品溶液制备方法，制成阴性对照品溶液。

2.3.5 专属性试验  在“2.3.1”色谱条件下，精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果阴性对照溶液在葛根素峰的位置无干扰峰干扰，专属性强。见图4。

2.3.6 线性关系的考察  精密吸取浓度分别为40、80、120、160、200、240 μg/mL的葛根素对照品溶液各10 μL，按照“2.3.1”项下色谱条件注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，以对照品溶液的浓度（C）为横坐标，进行线性回归，计算得葛根素回归曲线方程：Y = 21497X+1.9437（r = 0.999）。葛根素在40～240 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.7 精密度试验  取同一批号的供试品，照“2.3.3”项下处理方法，制成供试品溶液。照“2.3.1”项下色谱条件，进行测定，重复进样5次，测得葛根素峰面积值。其峰面积的RSD值为2.69%，表明仪器精密度良好。

2.3.8 重复性试验  取同一批号的供试品5份，每份约1 g，精密称定，按“2.3.3”项下方法制备5份供试品溶液，分别测定，记录峰面积。葛根素峰面积的RSD值为2.77%，表明该方法的重复性良好。

2.3.9 稳定性试验  取同一供试品溶液，按“2.3.1”项下条件，于0～16 h 内每2 h检测1次。1～16 h内葛根素峰面积的RSD值为2.9%，表明供试品溶液在16 h内稳定性良好。

2.3.10 加样回收率试验  称取同一批号供试品5份，每份约0.5 g，精密称定。精密加入3.64 mg/mL的葛根素对照品溶液1 mL，按“2.3.3”项下供试品溶液制备方法处理，按“2.3.1”项下色谱条件进行含量测定，供试品中葛根素的加样回收率的RSD值为0.44%，表明该方法提取效果良好。见表1。

2.3.11 定量限与检测限  采用信噪比法，精密量取2.3.2项下的葛根素对照品溶液适量，逐级稀释，按照2.3.1项下色谱条件注入液相色谱仪，当S/N=10时的质量浓度为定量限，当S/N=3时的质量浓度为检测限，测定峰面积。葛根素的定量限、检测限分别为1.91、0.53 μg/mL。

2.3.12 含量测定  取6批样品（20151001、20150902、20151003、20151101、20151102、20151103），每批3份，按2.3.3项下供试品溶液制备方法，制成供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，按照“2.3.1”项下色谱条件，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算6批样品中葛根素含量。6批样品葛根素的含量分别为6.0037、6.6698、6.0003、6.4610、5.6724、5.6358 mg/g。

3 讨论

本研究确定了葛根、甘草、酸枣仁、益智的显微鉴别方法，其重现性好，检出高，视野清楚;采用TCL法对健脑益神丸中的川芎、葛根进行了鉴别，结果色谱斑点清晰、分离度良好，且阴性无干扰;建立了健脑益神丸中葛根素含量测定的高效液相色谱法，该方法稳定、可行、专属性高，可有效控制健脑益神丸的质量。

分析处方，并确定君药。测定君药的主要成分，发现党参炔苷含量极低，样品处理非常繁琐，且文献资料[16-26]对党参含量测定很少;经验证，本制剂中党参炔苷含量测定重现性较差;处方中葛根素含量高，且葛根供试品处理简单易行，文献资料和2015版《中华人民共和国药典》对葛根素的含量测定较规范，同时，葛根在处方中有重要地位。综合比较，选定测定葛根素的含量。

本研究经过大量的文献资料分析和实验尝试，確定用乙醚超声20 min去杂质后用30%乙醇超声，可避免与葛根素极性相近的其他杂质的影响干扰，且能得到较为纯净的葛根素。乙醚超声去杂质对葛根素提取率影响不大，故本研究分别考察了超声15、20、25、30 min对葛根素提取率的影响，结果超声25 min时峰面积最大，故选择超声25 min。根据上述考察指标，乙醚超声20 min去杂质后，采用30%乙醇超声提取25 min最优。

本研究考察了流动相甲醇-水（30∶70）、甲醇-水（25∶75）、甲醇-水（22∶78）的分离效果，结果甲醇-水（25∶75）的分离效果最佳，故确定甲醇-水（25∶75）为流动相。

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（收稿日期：2017-12-29  本文编辑：王   蕾）