miRNA-101调控转化生长因子-β1信号通路参与肝纤维化的研究

白洁 纪文静 丁永年 彭媛媛 努尔麦麦提·叶尔逊

[摘要] 目的 探讨miRNA-101及转化生长因子（TGF）-β1信号通路在肝纤维化中的作用。 方法 选取2013年1月～2018年1月新疆医科大学第二附属医院手术切除的20例肝纤维化组织作为研究组，选择20例正常肝脏组织作为对照。采用免疫组化法分别检测肝组织中TGF-β1、平滑肌α-肌动蛋白（α-SMA）的表达水平，采用实时定量PCR（qRT-PCR）检测肝组织中TGF-β1、α-SMA的mRNA及miRNA-101的表达情况，分析TGF-β1、α-SMA及miRNA-101的相关性。 结果 肝纤维化组织中TGF-β1的mRNA表达水平明显高于正常肝组织（P < 0.05），肝纤维化组织中α-SMA的mRNA表达水平与正常肝组织比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。TGF-β1和α-SMA在肝纤维化组织中的阳性表达随肝纤维化程度的加重而增强，呈正相关（r = 0.53、0.57，均P < 0.05）。TGF-β1和α-SMA的mRNA表达水平呈正相关（r = 0.633，P < 0.01）。肝纤维化组织miRNA-101水平低于正常肝组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。miRNA-101与TGF-β1、α-SMA的mRNA表达水平呈负相关（r = -0.442、-0.327，均P < 0.01）。 结论 miRNA-101下调可能通过调控TGF-β1而参与肝纤维化。

[关键词] 微小RNA-101;转化生长因子-β1;肝纤维化

[中圖分类号] R575.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（a）-0016-05

肝纤维化是几乎所有慢性肝损伤所伴发的病理过程，肝纤维化最后可发展为肝硬化和肝衰竭。有研究表明，肌成纤维细胞的活化参与肝纤维化发病机制[1]，其中肝星状细胞（HSC）、门静脉成纤维细胞和骨髓来源的胶原生成细胞是三大细胞群。转化生长因子-β1（TGF-β1）是一种重要的促增殖介质，TGF-β1的过表达增加了胶原α1 mRNA和平滑肌α-肌动蛋白（α-SMA）的水平[2]，靶向TGF-β1可能是治疗肝纤维化的一种有效方法。microRNAs（miRNAs）是内源性的23 nts的RNAs，通过与蛋白质编码基因的mRNA配对参与基因调控[3]。研究发现，miRNAs参与促进和抑制HSC活化[4]，调节TGF-β1表达的miRNAs可能是调节TGF-β1诱导肝纤维化HSC活化的一种途径[5]。有研究发现，miRNA-101a通过靶向c-Fos抑制心肌纤维化[6]。然而，目前关于miRNA-101靶向TGF-β1或与肝纤维化有关的报道较少。本研究对TGF-β1、miRNA-101在肝纤维化组织和正常肝组织中的表达进行分析，并分析两组的相关性，希望为肝纤维化的预防治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月～2018年1月新疆医科大学第二附属医院（以下简称“我院”）收治的20例原发性肝癌合并肝纤维化患者为研究对象，根据Ohkuma′s分级标准[7]将肝组织纤维化分为4级，其中Ⅰ级6例，Ⅱ级7例，Ⅲ级5例，Ⅳ级2例。另选择20例因肝脏转移癌行肝脏切除患者的肝脏正常组织作为对照。两组年龄、性别、Child-Pugh肝功能分级等比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性，见表1。本研究通过医院医学伦理委员会批准，且患者及家属均知晓本次诊治方案，并签字确认。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测TGF-β1和α-SMA蛋白表达及结果判定  免疫组织化学染色方法采用SP法。TGF-β1和α-SMA单克隆抗体均购于北京中山生物技术有限公司，均为鼠抗人单克隆抗体。每组以PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色。其中TGF-β1和α-SMA以肝细胞膜出现黄色、棕黄色或黄褐色颗粒为阳性，同时每张切片随机选取10个400倍视野计算视野内阳性细胞占总细胞数的百分比，取其平均数，并综合染色强度以及阳性细胞所占比例进行判定[5]，染色强度评分：“-”为不着色，“+”为黄色，“++”为棕黄色，“+++”为黄褐色。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测肝脏TGF-β1、α-SMA的mRNA及miRNA-101的表达  样本中加Trizol 5 mL反复吹打，室温放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离，依次加入氯仿、异丙醇，4℃ 12 000 g离心10 min，弃上清，1 mL 75%乙醇（0.1%DEPC水临时配制并冰浴）洗涤RNA沉淀，4℃ 8000 g离心5 min，弃上清，自然晾干，200 μL DEPC水溶解，紫外分光光度计测定RNA浓度。使用Sigma公司TaqMan miRNA逆转录试剂盒反转录合成第一链cDNA。选择SimpliAmp公司的荧光定量PCR仪，采用Abcam公司的TaqMan PCR试剂盒对miRNA-101进行实时荧光定量PCR，miRNA的相对表达水平为2-△Ct，△Ct=Ct目的-Ct内参。miRNA-101上游引物为5′-TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC-3′，下游引物为5′-TCTGGACAGTCTGCAGTTGG-3′;TGF-β1上游引物为5′-AGCCGTTTGGAGGGGCGGTT-3′，下游引物为5′-GCTGCATGGTCAGCAGGGCA-3′;α-SMA上游引物为5′-GCTGCCCAGAGACCCTGTT-3′，下游引物为5′-TTTGATGGATGCCAGCAGACT-3′;GAPDH上游引物为5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3′，下游引物为5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAG-3′。PCR反应体系：10×扩增缓冲液10 μL，4种dNTP混合物各200 μmol/L，引物各100 μmol，模板DNA 0.1 μg，Taq DNA聚合酶2.5 μL，Mg2+ 1.5 mmol/L，加双蒸水或三蒸水至100 μL。按三步法进行DNA扩增，95℃ 20 s，94℃ 25 s，55℃ 15 s，75℃ 10 s，40次循环条件：72℃ 10 min。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验。TGF-β1、α-SMA的mRNA表达及miRNA-101表达的相关性分析采用Pearson相关分析法，TGF-β1、α-SMA蛋白表达与肝纤维化级别的相关性分析采用Spearman秩相关分析。以P < 0.05為差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝纤维化组织及正常肝组织中TGF-β1和α-SMA的mRNA表达

肝纤维化组织中TGF-β1的mRNA表达[（81.6±21.6）%]明显高于正常肝组织[（68.3±20.4）%]，差异有统计学意义（P < 0.05），肝纤维化组织中α-SMA的mRNA表达[（47.3±10.5）%]与正常肝组织[（41.1±11.3）%]比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。TGF-β1和α-SMA在肝纤维化组织中的蛋白表达随肝纤维化程度的加重而增强，呈正相关（r = 0.53，P < 0.05;r = 0.57，P < 0.05）。见表2、图2（封四）。TGF-β1和α-SMA的mRNA表达呈正相关（r = 0.633， P < 0.01）。见图3。

2.2 肝纤维化组织及正常肝组织中miRNA-101的表达水平比较

肝纤维化组织miRNA-101水平[（0.72±0.12）×105]低于正常肝组织[（1.05±0.02）×105]，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4。

2.3 肝纤维化组织中TGF-β1、α-SMA的mRNA表达与miRNA-101相关性分析

肝纤维化组织中miRNA-101与TGF-β1、α-SMA的mRNA表达呈负相关（r = -0.442、-0.327，均P < 0.01）。见图5。

3 讨论

肝纤维化是进一步向肝硬化发展的主要环节，以细胞外基质（ECM）积聚为特征。miRNA是肝纤维化的重要调控因子，多种miRNA被证实参与了肝脏纤维化过程[8-11]。

miRNA能与目标基因mRNAs的3′-非翻译区域的多个位点相结合，并负调节靶基因表达翻译水平[12]。由于miRNA可以调节几个功能相关的mRNA，且一个单一的基因可能受到多个miRNA的调控[12]，近年来miRNAs在肝纤维化中的作用是研究热点之一[8]。最近，已经报道了Let-7家族、miRNA-195、miRNA-99a、miRNA-130、miRNA-126、miRNA-230、miRNA-145和miRNA-199b在肝纤维化组织中特异性表达[8-11，13]。miRNA-101家族成员是从两个基因组位点转录的高度保守的miRNAs。有研究发现，miRNA-101在心肌纤维化中下调，进一步的体内研究表明miRNA-101通过靶向c-Fos抑制心脏纤维化[6]。目前关于miRNA-101与肝脏纤维化的关系及机制尚不清楚。TGF-β信号通路中的多个成分已经被证实为miRNAs的靶点，因此，miRNAs可能参与调节TGF-β受体在HSC活化和肝纤维化形成过程中的表达。本研究关注了miRNA-101及TGF-β1在肝纤维化组织中的表达情况，结果表明TGF-β1在人肝纤维化组织中表达上调，与HSC活化有关;miRNA-101在肝纤维化组织中表达下调，其表达与TGF-β1的表达呈负相关，这与有关研究结果基本一致[14-15]。

TGF-β1是肝纤维化最关键的细胞因子，对肝纤维化的发生发展具有重要的作用。TGF-β1可以调控miRNAs的表达，但是miRNAs也可以影响TGF-β1信号通路蛋白的表达，从而调节TGF-β1功能[16]。TGF-β1激活HSC细胞膜的TGF-β1/SMAD信号通路进而活化HSC[18]。此外，TGF-β1可以使HSC发生快速的功能和形态学改变，并成为纤维母细胞，分泌胶原和α-SMA[19]。ECM组分的改变可进一步刺激成纤维细胞和HSC活化，反过来使TGF-β1维持高水平[20]。α-SMA是TGF-β1信号传导通路的激活信号蛋白，有促进肝纤维化作用[17]。本研究中，TGF-β1蛋白在人肝纤维化组织中的表达明显增高，肝纤维化组织中α-SMA的表达率较高，且随着纤维化程度的增加，两者表达也随之增加。相关性分析结果显示，TGF-β1与α-SMA表达呈正相关，提示TGF-β1可以活化HSCs，促进其向肌成纤维细胞转化，诱导肝纤维化的发生。

总之，本研究验证肝纤维化患者肝脏组织miRNA-101表达下调，并揭示miRNA-101可能通过调控TGF-β1参与肝纤维化，有望为肝纤维化的防治提供新的思路。但本研究缺乏miRNA-101低表达的动物体内实验。今后，我们将通过构建肝纤维化动物模型，观察miRNA-101表达变化，并观察miRNA-101与TGF-β1通路的关系，以进一步验证本研究结果。

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