Akt抑制剂MK-2206对肝癌细胞huh7生物学行为的影响及机制

熊琳 何晓琴 范黎 徐细明

[摘要] 目的 探讨MK-2206作用于肝癌细胞huh7后对其生物学行为的影响及作用机制。 方法 体外培养人肝癌细胞系huh7，采用不同浓度（0、2.5、5、10、20、40 μmol/L）MK-2206干预huh7细胞。采用CCK-8检测细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达。 结果 与对照组（0 μmol/L）比较，MK-2206对肝癌细胞huh7的增殖活性有明显抑制作用，且呈剂量依赖性和时间依赖性（P < 0.05）;MK-2206诱导huh7细胞凋亡（P < 0.05），显著抑制Akt的蛋白表达（P < 0.05）。 结论 Akt抑制剂MK-2206可通过调控PI3K/Akt信号通路来调控肝癌细胞huh7的生物学行为。

[关键词] 肝癌;PI3K/Akt信号通路;MK-2206;增殖;迁移;凋亡

[中图分类号] R735.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（a）-0008-05

肝癌是世界第六大常见癌症，也是发生癌症相关死亡的第三大原因，近年来其发病率及死亡率仍呈上升趋势[1]。我国肝癌患者人数占全世界肝癌患者的55%[2]。手术切除是肝癌的首选治疗方法，但肝癌发病隐匿，恶性程度高，进展速度快，根治性手术仅可用于不足30%的患者[3]。因此，系统性治疗在中晚期肝癌患者的治疗中扮演着重要角色。传统的化疗方法副作用大，疗效不佳，易耐药[4]。分子靶向药物索拉非尼可改善中晚期肝癌患者生存期，但其仅可延长总体生存期数月[5-6]。目前，迫切需要开发出新的靶向治疗药物。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K/Akt信号转导通路的重要靶点，该通路在调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及自噬等方面中具有重要作用[7]，有望成为新的恶性肿瘤治疗靶点。MK-2206是一种人工合成的Akt特异性变构抑制剂，可有效抑制多种恶性肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，具有良好的抗肿瘤活性[8-9]。本研究以肝癌细胞huh7为研究对象，探讨MK-2206的抗肝癌作用及其可能的作用机制，以期为其抗肿瘤研究和临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器  超净工作台（美国AIRTECH）;CO2细胞培养箱（德国Binder）;普通及倒置显微镜（日本Olympus）;离心机（德国Thermo）;流式细胞仪（美国Bio-Rad）;酶标仪（美国PerKin Elmer）;超低温冰箱（New Brunswick Scientific）、电热恒温干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）;SDS-PAGE电泳（北京六一生物科技有限公司）;Odyssey双色红外激光成像系统（美国LI-COR）等。

1.1.2 试剂  DMEM（美国Gibco公司）;胎牛血清（美国Gibco公司）;青链霉素（美国Hyclone）;胰蛋白酶-EDTA（美国Hyclone）;胰蛋白酶（美国Hyclone），MK-2206（selleck公司）;CCK-8试剂（日本Dojindo）;细胞凋亡试剂盒（美国Bio-rad）;BCA蛋白定量试剂盒（美国Sigma）;蛋白上样缓冲液（日本Takara）;蛋白Marker（日本Takara）;蛋白抗体（美国Abcam）等。

1.1.3 细胞系  人肝癌细胞huh7细胞购自上海中国科学院细胞库。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与传代  将huh7细胞接种于含10%灭活胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，每2 d为细胞更换培养液1次。于显微镜下观察细胞生长状态，待细胞生长到覆盖瓶底70%～80%面积时，可进行传代接种。弃瓶内的培养基，用1 mL胰酶均匀覆盖瓶底，在培养箱孵育1～2 min，待細胞收缩变圆，用培养基终止消化，离心，弃上清，按1∶3传代，用于后续实验。

1.2.2 CCK-8细胞生长抑制率检测  取对数生长期的huh7细胞，0.5%胰酶消化1 min后，RT 1000 g/min离心5 min，重悬培养基，调整细胞浓度为5×105/mL，接种于3块96孔板，每孔加入上述细胞悬液100 μL。待细胞贴壁后加入MK-2206，使药物终浓度分别为2.5、5、10、20和40 μmol/L，每种浓度组以及阴性对照组均设5个复孔。分别在加药后24、48、72 h后加入CCK-8（10 mg/mL）10 μL，于37℃培养箱孵育30 min～1 h，以490 nm为检测波长，用酶标仪读取吸光度，取5个复孔的平均值。上述实验重复3次。抑制率=1-（OD加药孔-OD调零孔）/（OD对照孔-OD调零孔）。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率  收集不同药物浓度（0、2.5、5、10、20和40 μmol/L）处理24 h后的huh7细胞，收集原培养基，用0.5%不含EDTA的胰蛋白酶0.5 mL消化各孔，30 s～1 min后终止消化，将原培养基和消化液一同离心，RF 2000 g/min离心5 min。其后，弃上清，用2 mL 4℃预冷磷酸盐缓冲液（PBS）悬浮细胞，2000 g/min，离心5 min。重复上述步骤一次，弃PBS，加入100 μL Binding buffer，加入5 μL异硫氰酸荧光素（FITC），涡旋混匀后，加入10 μL碘化丙啶（PI），室温避光孵育5 min，再补充加入400 μL Binding buffer后上机检测。上述实验重复3次。细胞总凋亡率=早期凋亡率（Annexin+/PI-）+晚期凋亡率（Annexin+/PI+）。

1.2.4 Western blot测蛋白表达量差异  取对数生长期huh7细胞，接种于6孔板，待细胞贴壁24 h后，用不同药物浓度（0、2.5、5、10、20和40 μmol /L）处理24 h。加入 4℃预冷的细胞裂解缓冲液100 μL后，冰上作用30 min。用细胞刮刀刮取细胞碎片和裂解产物，移入1.5 mL离心管。用超声波细胞粉碎机粉碎上述产物后，4℃ 12 000 g/min高速冷冻离心20 min。BCA检测法检测蛋白浓度，用细胞裂解缓冲液调整各组间的蛋白浓度，使其一致，加入上样缓冲液，100℃加热5 min。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）凝胶电泳，将分离后蛋白电泳转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，洗膜3次后分别加入一抗（Akt、p-Akt、β-catenin及GAPDH）4℃摇床过夜孵育12 h，而后洗膜3次，加入二抗于摇床作用1 h，再次洗膜3次，于Odyssey上扫膜，并计算灰度值。上述实验重复3次。相对灰度值=目的蛋白灰度值/内参灰度值。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，等级资料比较用秩和检验;计数资料用率表示，组间比较采用成组χ2检验，多组间比较采用方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MK-2206对huh7的生长抑制作用

CCK-8实验结果表明，不同浓度MK-2206处理huh7细胞24、48、72 h后均能抑制细胞生长增殖，且抑制效应呈时间和浓度依赖性。MK-2206的24、48、72 h的半抑制浓度（IC50）分别为5.467、2.961、1.924 μmol/L。当药物浓度达到40 μmol/L时，在不同药物作用时间下均可使huh7几乎全数死亡。见图1。

2.2 MK-2206对细胞凋亡的影响

取MK-2206浓度0、2.5、5、10、20和40 μmol/L，作用huh7细胞24 h后，利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果显示，除外2.5 μmol/L，与空白对照组（0 μmol/L）比较，其余各浓度组的凋亡率明显升高，且呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2、表1。当药物浓度达到40 μmol/L时，镜下观察，huh7细胞几乎全数死亡，流式图中呈现单一细胞团。其后增设浓度组，即取0、2.5、5、10、20、25、30、35和40 μmol/L作用于huh7细胞24 h后检测细胞凋亡情况。结果当药物浓度达到30 μmol/L，即出现huh7细胞大量凋亡。见图2A。

2.3 MK-2206对Akt/PI3K/mTOR信号通路的影响

药物浓度达40 μmol/L时，huh7细胞出现大量凋亡，其提取所得蛋白的浓度过低，无法显示出蛋白条带。Western blot结果显示，与空白对照组（0 μmol/L）比较，Akt蛋白表达水平随MK-2206的浓度升高而显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）;与空白对照组比较，p-Akt蛋白水平表达无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

3 讨论

肝癌的发生率及死亡率呈上升趋势，是我国沉重的经济负担。目前的治疗方式使患者获益有限，急需探索新的治疗方式[10]。PI3K/Akt在多种肿瘤中高表达，参与肿瘤的恶性进展，同时在肝癌恶性进展及化疗耐药中起到重要的作用[11-12]。Akt作为PI3K的下游靶蛋白，是PI3K/Akt信号通路的核心靶点。因此，通过调控Akt表达可调整细胞增殖和凋亡的平衡，进而抑制肿瘤生长[13]。MK-2206可促进急性髓性白血病细胞的凋亡，并且增加阿糖胞苷的细胞毒性[14]。MK-2206可通过抑制MAPK信号通路抑制胃癌细胞生长[15]。同时，MK-2206也抑制结肠癌肿瘤干细胞的增殖[16]。在临床研究中，MK-2206也展示出了良好的治疗效果[17-19]。本研究發现，MK-2206可以抑制huh7细胞的增殖，且抑制效应呈浓度和时间依赖性;MK-2206可以促进huh7细胞的凋亡，且呈浓度依赖性。MK-2206可通过抑制huh7中的PI3K/Akt信号通路来发挥抗肿瘤作用。

本研究的不足之处：①实验对象单一，缺乏体外实验，后期可以对具有高侵袭能力的肝癌细胞系开展相关研究;②本研究只对PI3K/Akt信号通路上的关键蛋白进行了蛋白表达水平的验证，缺乏对这两条通路的下游靶蛋白表达水平的验证;③本研究缺少凋亡相关蛋白的表达水平的验证。

综上所述，研究发现Akt抑制剂MK-2206通过抑制PI3K/Akt信号通路促进肝癌细胞系huh7的凋亡，从而达到抑制肿瘤生长的目的。后期可进一步完善MK-2206对肝癌细胞抗肿瘤作用的研究。

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（收稿日期：2018-06-06  本文編辑：王   蕾）