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Akt抑制剂MK-2206对肝癌细胞huh7生物学行为的影响及机制

2019-03-14熊琳何晓琴范黎徐细明

中国医药导报 2019年1期
关键词:缓冲液肝癌通路

熊琳 何晓琴 范黎 徐细明

[摘要] 目的 探讨MK-2206作用于肝癌细胞huh7后对其生物学行为的影响及作用机制。 方法 体外培养人肝癌细胞系huh7,采用不同浓度(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)MK-2206干预huh7细胞。采用CCK-8检测细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达。 结果 与对照组(0 μmol/L)比较,MK-2206对肝癌细胞huh7的增殖活性有明显抑制作用,且呈剂量依赖性和时间依赖性(P < 0.05);MK-2206诱导huh7细胞凋亡(P < 0.05),显著抑制Akt的蛋白表达(P < 0.05)。 结论 Akt抑制剂MK-2206可通过调控PI3K/Akt信号通路来调控肝癌细胞huh7的生物学行为。

[关键词] 肝癌;PI3K/Akt信号通路;MK-2206;增殖;迁移;凋亡

[中图分类号] R735.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210(2019)01(a)-0008-05

肝癌是世界第六大常见癌症,也是发生癌症相关死亡的第三大原因,近年来其发病率及死亡率仍呈上升趋势[1]。我国肝癌患者人数占全世界肝癌患者的55%[2]。手术切除是肝癌的首选治疗方法,但肝癌发病隐匿,恶性程度高,进展速度快,根治性手术仅可用于不足30%的患者[3]。因此,系统性治疗在中晚期肝癌患者的治疗中扮演着重要角色。传统的化疗方法副作用大,疗效不佳,易耐药[4]。分子靶向药物索拉非尼可改善中晚期肝癌患者生存期,但其仅可延长总体生存期数月[5-6]。目前,迫切需要开发出新的靶向治疗药物。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是PI3K/Akt信号转导通路的重要靶点,该通路在调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及自噬等方面中具有重要作用[7],有望成为新的恶性肿瘤治疗靶点。MK-2206是一种人工合成的Akt特异性变构抑制剂,可有效抑制多种恶性肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,具有良好的抗肿瘤活性[8-9]。本研究以肝癌细胞huh7为研究对象,探讨MK-2206的抗肝癌作用及其可能的作用机制,以期为其抗肿瘤研究和临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器  超净工作台(美国AIRTECH);CO2细胞培养箱(德国Binder);普通及倒置显微镜(日本Olympus);离心机(德国Thermo);流式细胞仪(美国Bio-Rad);酶标仪(美国PerKin Elmer);超低温冰箱(New Brunswick Scientific)、电热恒温干燥箱(天津泰斯特仪器有限公司);SDS-PAGE电泳(北京六一生物科技有限公司);Odyssey双色红外激光成像系统(美国LI-COR)等。

1.1.2 试剂  DMEM(美国Gibco公司);胎牛血清(美国Gibco公司);青链霉素(美国Hyclone);胰蛋白酶-EDTA(美国Hyclone);胰蛋白酶(美国Hyclone),MK-2206(selleck公司);CCK-8试剂(日本Dojindo);细胞凋亡试剂盒(美国Bio-rad);BCA蛋白定量试剂盒(美国Sigma);蛋白上样缓冲液(日本Takara);蛋白Marker(日本Takara);蛋白抗体(美国Abcam)等。

1.1.3 细胞系  人肝癌细胞huh7细胞购自上海中国科学院细胞库。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与传代  将huh7细胞接种于含10%灭活胎牛血清的DMEM培养液中,在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养,每2 d为细胞更换培养液1次。于显微镜下观察细胞生长状态,待细胞生长到覆盖瓶底70%~80%面积时,可进行传代接种。弃瓶内的培养基,用1 mL胰酶均匀覆盖瓶底,在培养箱孵育1~2 min,待細胞收缩变圆,用培养基终止消化,离心,弃上清,按1∶3传代,用于后续实验。

1.2.2 CCK-8细胞生长抑制率检测  取对数生长期的huh7细胞,0.5%胰酶消化1 min后,RT 1000 g/min离心5 min,重悬培养基,调整细胞浓度为5×105/mL,接种于3块96孔板,每孔加入上述细胞悬液100 μL。待细胞贴壁后加入MK-2206,使药物终浓度分别为2.5、5、10、20和40 μmol/L,每种浓度组以及阴性对照组均设5个复孔。分别在加药后24、48、72 h后加入CCK-8(10 mg/mL)10 μL,于37℃培养箱孵育30 min~1 h,以490 nm为检测波长,用酶标仪读取吸光度,取5个复孔的平均值。上述实验重复3次。抑制率=1-(OD加药孔-OD调零孔)/(OD对照孔-OD调零孔)。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率  收集不同药物浓度(0、2.5、5、10、20和40 μmol/L)处理24 h后的huh7细胞,收集原培养基,用0.5%不含EDTA的胰蛋白酶0.5 mL消化各孔,30 s~1 min后终止消化,将原培养基和消化液一同离心,RF 2000 g/min离心5 min。其后,弃上清,用2 mL 4℃预冷磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮细胞,2000 g/min,离心5 min。重复上述步骤一次,弃PBS,加入100 μL Binding buffer,加入5 μL异硫氰酸荧光素(FITC),涡旋混匀后,加入10 μL碘化丙啶(PI),室温避光孵育5 min,再补充加入400 μL Binding buffer后上机检测。上述实验重复3次。细胞总凋亡率=早期凋亡率(Annexin+/PI-)+晚期凋亡率(Annexin+/PI+)。

1.2.4 Western blot测蛋白表达量差异  取对数生长期huh7细胞,接种于6孔板,待细胞贴壁24 h后,用不同药物浓度(0、2.5、5、10、20和40 μmol /L)处理24 h。加入 4℃预冷的细胞裂解缓冲液100 μL后,冰上作用30 min。用细胞刮刀刮取细胞碎片和裂解产物,移入1.5 mL离心管。用超声波细胞粉碎机粉碎上述产物后,4℃ 12 000 g/min高速冷冻离心20 min。BCA检测法检测蛋白浓度,用细胞裂解缓冲液调整各组间的蛋白浓度,使其一致,加入上样缓冲液,100℃加热5 min。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)凝胶电泳,将分离后蛋白电泳转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h,洗膜3次后分别加入一抗(Akt、p-Akt、β-catenin及GAPDH)4℃摇床过夜孵育12 h,而后洗膜3次,加入二抗于摇床作用1 h,再次洗膜3次,于Odyssey上扫膜,并计算灰度值。上述实验重复3次。相对灰度值=目的蛋白灰度值/内参灰度值。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验,等级资料比较用秩和检验;计数资料用率表示,组间比较采用成组χ2检验,多组间比较采用方差分析,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MK-2206对huh7的生长抑制作用

CCK-8实验结果表明,不同浓度MK-2206处理huh7细胞24、48、72 h后均能抑制细胞生长增殖,且抑制效应呈时间和浓度依赖性。MK-2206的24、48、72 h的半抑制浓度(IC50)分别为5.467、2.961、1.924 μmol/L。当药物浓度达到40 μmol/L时,在不同药物作用时间下均可使huh7几乎全数死亡。见图1。

2.2 MK-2206对细胞凋亡的影响

取MK-2206浓度0、2.5、5、10、20和40 μmol/L,作用huh7细胞24 h后,利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果显示,除外2.5 μmol/L,与空白对照组(0 μmol/L)比较,其余各浓度组的凋亡率明显升高,且呈浓度依赖性,差异有统计学意义(P < 0.05)。见图2、表1。当药物浓度达到40 μmol/L时,镜下观察,huh7细胞几乎全数死亡,流式图中呈现单一细胞团。其后增设浓度组,即取0、2.5、5、10、20、25、30、35和40 μmol/L作用于huh7细胞24 h后检测细胞凋亡情况。结果当药物浓度达到30 μmol/L,即出现huh7细胞大量凋亡。见图2A。

2.3 MK-2206对Akt/PI3K/mTOR信号通路的影响

药物浓度达40 μmol/L时,huh7细胞出现大量凋亡,其提取所得蛋白的浓度过低,无法显示出蛋白条带。Western blot结果显示,与空白对照组(0 μmol/L)比较,Akt蛋白表达水平随MK-2206的浓度升高而显著降低,差异有统计学意义(P < 0.05);与空白对照组比较,p-Akt蛋白水平表达无明显变化,差异无统计学意义(P > 0.05)。见图3。

3 讨论

肝癌的发生率及死亡率呈上升趋势,是我国沉重的经济负担。目前的治疗方式使患者获益有限,急需探索新的治疗方式[10]。PI3K/Akt在多种肿瘤中高表达,参与肿瘤的恶性进展,同时在肝癌恶性进展及化疗耐药中起到重要的作用[11-12]。Akt作为PI3K的下游靶蛋白,是PI3K/Akt信号通路的核心靶点。因此,通过调控Akt表达可调整细胞增殖和凋亡的平衡,进而抑制肿瘤生长[13]。MK-2206可促进急性髓性白血病细胞的凋亡,并且增加阿糖胞苷的细胞毒性[14]。MK-2206可通过抑制MAPK信号通路抑制胃癌细胞生长[15]。同时,MK-2206也抑制结肠癌肿瘤干细胞的增殖[16]。在临床研究中,MK-2206也展示出了良好的治疗效果[17-19]。本研究發现,MK-2206可以抑制huh7细胞的增殖,且抑制效应呈浓度和时间依赖性;MK-2206可以促进huh7细胞的凋亡,且呈浓度依赖性。MK-2206可通过抑制huh7中的PI3K/Akt信号通路来发挥抗肿瘤作用。

本研究的不足之处:①实验对象单一,缺乏体外实验,后期可以对具有高侵袭能力的肝癌细胞系开展相关研究;②本研究只对PI3K/Akt信号通路上的关键蛋白进行了蛋白表达水平的验证,缺乏对这两条通路的下游靶蛋白表达水平的验证;③本研究缺少凋亡相关蛋白的表达水平的验证。

综上所述,研究发现Akt抑制剂MK-2206通过抑制PI3K/Akt信号通路促进肝癌细胞系huh7的凋亡,从而达到抑制肿瘤生长的目的。后期可进一步完善MK-2206对肝癌细胞抗肿瘤作用的研究。

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(收稿日期:2018-06-06  本文編辑:王   蕾)

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