Wnt信号通路及其抑制剂Dickkopf-1在骨关节炎中的作用探讨

樊梅 唐芳 马武开 兰维娅 李宇 蒋总 蔡鑫

【摘 要】 Dickkopf-1是Wnt信号通路中重要的拮抗分子之一，其主要作用是拮抗Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路的传导，主要通过与LPR5/6竞争性地结合，从而阻止Wnt蛋白与细胞膜上的卷曲蛋白结合，使Wnt/β-catenin/TCF传导受阻，不能抑制成骨细胞增殖、分化和骨形成。主要探讨Wnt信号通路及其抑制剂Dickkopf-1在骨关节炎中的作用以及对近几年的研究情况进行分析，希望能为骨关节炎的治疗提供新的思路及理论依据。

【关键词】 骨关节炎;Dickkopf-1;Wnt信号通路;作用探讨

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种主要见于50岁以上中老年人的以关节软骨退行性病变为特征的疾病，常累及负重关节及双手远端关节，以活动后关节疼痛、运动受限和关节变形为主要临床表现。通常认为与年龄、肥胖、地理和遗传因素等有关[1]。关节软骨病变是OA发病的主要病理基础，以后逐渐侵犯软骨下骨板、滑膜等关节周围组织，引起局灶性、侵蚀性软骨的破坏、硬化、囊性变和代偿性骨赘形成。最终，整个关节软骨发生退行性变、纤维化、断裂、溃疡和整个关节面的损伤[2]。早在1999年，WHO就将OA、心血管病和恶性肿瘤列为威胁人类健康的三大杀手，称其为“不死的癌症”[3]。

OA的发病机制复杂，涉及多方面的因素，严重影响人们的生活质量，目前还未找到能从根本上治疗OA的方法，主要采用局部热敷、理疗、抗炎镇痛等对症治疗，在晚期病情严重时，需通过人工关节置换以缓解病情。因此，挖掘出阻止OA进展及逆转病变的新药物显得十分重要。多项研究发现，经典Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路中的相关蛋白和受体与OA的发生发展密切相关，在不同阶段影响着骨骼系统相关疾病和骨代谢[4]。

1Dickkopf-1（DKK1）

DKKs是一组含半胱氨酸的蛋白质，至少有4种形式，即DKK1、DKK2、DKK3、DKK4。DKK1是一种分泌型糖蛋白，是Wnt/β-catenin信号通路的主要抑制剂，对骨形成有一定的影响[5]。Dickkopf-1在1998年首次被人类发现，编码为DKK1，主要出现在蟾蜍这种两栖动物的胚胎细胞中[6]。DKK1主要位于人类10号染色体上（10q11），哺乳动物的DKK1主要包含266个氨基酸残基，由cDNA编码，称为保守的半胱氨酸丰富区，由50～55个氨基酸结合区分开[7-8]。目前已知的DKK1受体主要有两种：低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6和含kringle结构域的Kremen蛋白受体[9]。

2 Wnt信号通路

早在1973年，SHARMA就发现果蝇胚胎中的WG基因，1982年NUSSE等在小鼠乳腺肿瘤病毒整合位点中发现Wntl基因[10]，并通过研究证实两者具有同源性，所以该基因被命名为Wnt基因家族，1990年，发现Wnt/β-catenin信号通路与人类疾病密切相关[11]。目前认为，Wnt家族可能参与多种信号通路，即Wnt/β-catenin信号通路、Wnt/ca信号通路、平面极细胞信号通路、纺锤体细胞信号转导通路和非对称细胞分裂信号通路等，其中最经典的信号传导途径是Wnt/β-catenin信号通路[12]。

Wnt/β-catenin信号通路主要由配体Wnt家族分子、调控蛋白如腺瘤性息肉病蛋白（APC）、分散蛋白（DVL）、β-catenin、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、轴蛋白（Axin）等组成。跨膜受体如LRP5/6、卷曲蛋白家族分子（Fz）和核转录因子T细胞因子（TCF/LeF1）家族[13]。Wnt分子通过与LRP5/6和Fz等跨膜受体结合，激活细胞中的DVL蛋白，抑制GSK-3β的活化，阻止β-catenin的磷酸化，使β-catenin在细胞浆内逐渐积聚，并转移到细胞核中，进一步与转录因子TCF/LeF1成员结合，激活下游靶基因如CD44、c-myc、cyclin D1、骨保护素（OPG）和基质金属蛋白酶（MMPs）等的转录和表达[14-16]。

3 DKK1与Wnt信号通路

Wnt/β-catenin信号通路上存在很多细胞外的抑制因子，如分泌性卷曲蛋白相关蛋白（sFRPs）、Dkk1蛋白、Wnt抑制因子-1（WIF-1）以及sclerostin等[17]，它们可以在不同的作用位点上调节Wnt/β-catenin信号通路。DKK1作为Wnt信号通路的抑制剂之一，主要是通过直接与Wnt蛋白竞争性地结合LRP5/6受体，或者间接与其两类受体Kremen蛋白受体和LRP受体形成三聚体，使Wnt蛋白活性受到明显抑制，不能向细胞内传导，Wnt/β-catenin/TCF通路受阻，导致Wnt信号通路参与调节骨形成和维持骨关节稳态的作用受到影響[18]。

4 DKK1/Wnt通路与OA的认识

OA主要是由于关节软骨损伤引起，最终以关节软骨破坏和关节间隙狭窄、骨赘形成和软骨骨化为特点。研究发现，Wnt/β-catenin信号通路在正常骨骼形成中起着决定性的作用，其中β-catenin在骨形成以及成骨细胞的增殖、分化和成熟过程中最为关键，β-catenin功能的缺失会使软骨细胞在关节面和关节软骨中的表达减少，降低软骨细胞的增殖和分化，加速软骨细胞的凋亡，从而影响骨的生长，因此β-catenin在成骨细胞发展的早期阶段是必不可少的[19];刘兴振等[20]的研究与此不谋而合。而DKK1作为Wnt信号通路的拮抗剂，一方面，它的过度表达会导致β-catenin水平降低，抑制成骨细胞分化并促进成骨细胞凋亡;另一方面，当DKK1被拮抗后，Wnt信号与LPR5/6相结合，可阻止β-catenin的降解，使β-catenin在细胞浆中累积，刺激OPG的产生，起到保护骨的作用[21]。所以DKK1功能的正常，常使Wnt/β-catenin信号通路的功能保持一定的度，使关节软骨不会因该通路功能的过度亢进或抑制而出现损伤。Wnt/β-catenin信号通路的激活导致骨形成加速和软骨破坏，向OA发展;但Wnt/β-catenin信号通路受到抑制，骨形成的速率就会减慢，导致相应的骨减少，还将导致关节软骨细胞凋亡和破坏，进展为OA[22]。DKK1是Wnt通路中的重要阻断剂，虽然其分子机制尚不完全清楚，但在OA中的作用是肯定的。

王彦鹏等[23]临床研究发现，OA患者血清DKK1水平下降，表明它对OA起重要作用，在OA膝关节的滑膜、软骨及软骨下的成骨细胞中均有表达，DKK1的分泌是OA的重要调节剂，它抑制成骨细胞分化的同时也抑制OPG的表达，使破骨细胞增加，对关节重构起重要的调控作用。正常关节软骨基质含有丰富的水分，主要由胶原和蛋白多糖组成，其结构由各种类型的胶原连接成纤维网，纤维网又被高浓度蛋白多糖聚合物溶液包裹。研究发现，DKK1还与Wnt信号通路中下游因子（如MMP-9、MMP-13等）有关，OA患者血清DKK1水平与MMP-13水平呈负相关，当DKK1在血清中降低时，调节MMP-13的能力就相应地减弱，MMP-13水平明显升高，使細胞外基质降解，水解Ⅱ型胶原的速度加快，软骨的拱形纤维结构被明显破坏，最终关节软骨被损伤，导致OA的发生[24]。而DKK1与MMP-9导致OA的机制与MMP-13大致相似。李强等[25]通过酶联免疫吸附法比较OA组与正常对照组血清中DKK1的含量，发现OA组人体血清中DKK1的浓度显著低于正常对照组，这表明血清中DKK1水平越低，就越可能获得OA，而正常人血清中的DKK1含量明显高于OA患者，提示DKK1可能有预防或缓解关节炎症的作用。因此，无论DKK1是否处于血清水平或骨中表达水平，都可调节骨形成或吸收，从而影响骨代谢和重塑。

许多动物实验研究表明，DKK1作为Wnt/β-catenin信号通路的上游抑制剂之一，在小鼠OA模型中，小剂量DKK1增加可能抑制关节软骨退变。据相关报道，通过抑制TNF转基因小鼠OA模型体内的DKK1，部分软骨细胞损伤得到了逆转[26]。在关节炎小鼠中，关节中DKK1含量的增加与疾病严重程度密切相关，敲除DKK1引起小鼠软骨细胞凋亡，软骨下骨丢失，而β-catenin水平升高，抗DKKl治疗增加了OA膝关节的骨密度以及骨小梁的骨量[27]。CAO等[28]认为，DKK1过表达会导致β-catenin水平降低，抑制成骨细胞分化，促进成骨细胞凋亡，下调DKK1的表达则促进骨形成，表明小鼠体内骨的含量与DKK1相反，DKK1和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6结合促进骨形成。

治疗方面，有学者用DKKl特异性抗体特异性地阻断小鼠关节腔内DKKl含量，导致小鼠血清中的破骨细胞显著减量，而OPG含量却明显增加，导致骨的吸收被抑制[29]。WANG等[30]用DKKl反义寡核苷酸治疗因炎症及机械外力所致骨关节炎小鼠模型时，可导致骨破坏刺激因子RANKL的表达和破骨细胞的分化被抑制，能有效缓解关节软骨和软骨下骨的破坏。GLANTSCHNIG等[31]也做了一项研究，即找到1个半月的去势小鼠，给予人抗DKKl的多克隆抗体经皮下注射，1个月后检测骨密度被依赖性地提高，2个月后骨量显著升高。因此，DKK1作为Wnt信号通路中重要的细胞外抑制因子，可能是治疗退行性OA的较好靶点[32]。

5 展 望

综上所述，DKK1可能参与了OA的发生、发展及治疗过程，通过干预其在血清或关节滑液中的含量，可能会起到治疗OA的作用。而DKK1功能的发挥大多是通过拮抗Wnt信号通路实现的，随着社会和科学的发展，对DKK1的表达机制和功能的研究将进一步深入，其与Wnt信号通路的相互作用和机制将更加明了，将来更好地应用于相关疾病的诊断、治疗、预防和预后恢复中，为相关疾病的研究提供更新的思路，开阔出更广的领域。虽然目前对DKKl的研究还不是特别清晰，但上述许多实验研究都表明，DKK1确实可作为治疗OA的一个重要靶点，相信更多的DKK1小分子拮抗剂将被用于未来的药物开发和临床应用。

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