VEGF/VEGFR 2信号通路调控机制的研究进展

陈东，冯林森，王羽丰#昆明医科大学第三附属医院暨云南省肿瘤医院干部医疗科，昆明6508

2昆明医科大学第六附属医院暨云南省玉溪市人民医院血液科，云南 玉溪6534050

自1971年Folkman[1]首先提出“实体恶性肿瘤的生长和转移离不开新生血管”这一观点后，人们逐渐认识到肿瘤的发展过程与血管新生密切相关，因此，抗肿瘤血管生成的研究不断深入。肿瘤血管新生的过程受肿瘤微环境中诸多因素的影响，目前已知的共同调节血管生成的信号通路有数十种，其中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）构成的信号通路是作用最强的正性调控通路之一，对血管新生的整个过程进行调节，发挥了不可替代的作用。然而有关VEGF/VEGFR2信号通路上游的分子调控机制尚不明确，本文通过总结调控该信号通路的潜在靶点，以期为相关研究提供参考。

1 EMP 2与VEGF/VEGFR 2信号通路

上皮细胞膜蛋白2（epithelial membrane protein 2，EMP2）是属于生长抑制特异性基因3（growth arrest-specific gene 3，GAS3）/外周髓鞘蛋白 22（peripheral myelin protein 22，PMP22）家族的四聚体蛋白[2]，广泛分布于Ⅰ型肺泡细胞、子宫内膜细胞、皮肤角质细胞、视网膜色素上皮细胞及角膜上皮细胞中[3-6]。在子宫内膜癌、多形性胶质母细胞瘤中，EMP2可正性调节VEGF并加速血管生成。Gordon等[7]在子宫内膜癌移植瘤模型中发现，EMP2与VEGF的分泌水平呈正相关。逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）结果表明，EMP2过表达组的VEGF mRNA表达水平升高，EMP2低表达组的VEGF mRNA表达水平下降。该研究认为，在缺氧的条件下，EMP2可促进局部黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）和原癌基因SRC活化，从而上调缺氧诱导因子1A（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF1A）的表达，通过HIF1A依赖途径诱导VEGF的表达，并最终诱导毛细血管新生。然而EMP2对HIF1A表达的调控机制仍不明确，需进一步研究。Morales等[8]在视网膜色素上皮细胞中也得到了类似的结果，蛋白质印迹（Western blot）和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）结果表明，EMP2过表达组的VEGF水平较对照组高150%，而EMP2低表达组的VEGF水平较对照组低57%；采用过表达EMP2的视网膜色素上皮细胞上清液培养血管内皮细胞后，内皮细胞的迁移和成管能力明显升高。该研究认为，EMP2对VEGF的上调作用有望成为视网膜疾病抗血管治疗的全新靶点。Qin等[9]研究发现，EMP2在胶质母细胞瘤患者中具有较高的特异性。后续研究发现，EMP2可促进多形性胶质母细胞瘤的血管生成，通过增加血管内皮细胞生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的分泌与表达，加速内皮细胞迁移和毛细血管形成；在肿瘤细胞中加入抗EMP2免疫球蛋白G1（immunoglobulin G1，IgG1）抗体后，VEGFA水平明显下降[10]。该研究还认为，在胶质母细胞瘤中，血脑屏障的完整性被破坏，抗EMP2 IgG1抗体成功通过率提高，有望成为胶质母细胞瘤的新型靶向药物。此外，Wang等[11]研究发现，EMP2对多形性胶质母细胞瘤的侵袭具有促进作用，体内试验和体外实验中应用EMP2抗体后，肿瘤细胞数量明显减少，肿瘤负荷明显下降。

虽然上述研究中应用EMP2抗体对VEGF的抑制效果可观，但其作用机制可能不仅仅局限于抗血管生成，且远期疗效仍需大量研究证实。此外，不同的恶性肿瘤中，EMP2扮演着截然不同的角色。在B细胞淋巴瘤、鼻咽癌、泌尿上皮癌中，EMP2可促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤进展及侵袭[11-13]；而在乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌和胶质母细胞瘤中，EMP2的表达明显上调，其表达水平与肿瘤的进展和侵袭呈正相关，研究认为EMP2可成为上述4种肿瘤的预后标志物，并有望成为潜在的治疗靶点[14-16]。

2 miRNA-29 a与VEGF/VEGFR 2信号通路

微小RNA-29a（microRNA-29a，miRNA-29a）属于miRNA-29家族成员（miRNA-29a/b/c）之一，大量研究已证实miRNA-29a与肿瘤细胞的增殖、凋亡[17]、侵袭[18]、预后[19]、耐药[20]等有关。在胃癌中，miRNA-29可通过抑制VEGFA的表达减少肿瘤血管新生。李学成等[21]应用定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和ELISA技术分别检测50例胃癌患者的血清miRNA-29a及VEGFA水平，发现两者的表达呈负相关；根据miRNA-29a的表达水平，将113例胃癌组织分为高表达组和低表达组，免疫组织化学染色结果显示，高表达组中VEGFA的表达量明显高于低表达组。王国威等[22]采用双荧光素酶实验进一步明确，miRNA-29a可直接与VEGFA mRNA的3'UTR相应位点结合，促进VEGFA mRNA的降解，从而下调VEGFA的表达水平。体内研究证实，miRNA-29a可明显抑制裸鼠移植瘤生长，并降低移植瘤内微血管密度（microvascular density，MVD），该结果可能与miRNA-29a抑制VEGFA的表达有关[23]。Zhang 等[24]研究发现，miRNA-29a/c过表达可降低胃癌细胞中VEGFA的表达水平，将胃癌细胞与内皮细胞共培养后，内皮细胞的生长、增殖和管腔形成明显受到抑制；细胞微泡能够有效地将miRNA-29a/c运输至胃癌细胞内，某种程度上发挥了载体和保护的功能。

有关miRNA的研究为靶向或基因治疗提供了新的临床思路，虽然miRNA-29a能有效抑制VEGF的分泌与表达，但其抗血管生成效果及安全性还需进一步研究。

3 miRNA-377与VEGF/VEGFR 2信号通路

诸多研究发现，微小RNA-377（microRNA-377，miRNA-377）可抑制食管癌和胃癌的发展，并通过抑制VEGF的表达调控血管生成。Li等[25]研究发现，miRNA-377在食管鳞癌组织标本及患者血清中的表达水平均明显下降，其表达水平与患者的生存期呈正相关，与病理分期、远处转移均呈负相关；miRNA-377过表达可抑制食管鳞癌的生长、远处转移及血管生成，而miRNA-377低表达后结果相反；荧光素酶实验证实miRNA-377可直接结合VEGF的3'UTR。Wang等[26]研究发现，胃癌细胞及组织标本中miRNA-377的表达量均低于正常细胞及组织；体外实验中，miRNA-377过表达可抑制胃癌细胞的生长及迁移；构建pcDNA 3.1-VEGFA载体后，miRNA-377对VEGFA的抑制效果可发生逆转，进一步证实了miRNA-377可通过下调VEGFA的表达抑制胃癌的进展。Wen等[27]在体外实验中将miRNA-377抑制剂转染至人脐静脉内皮细 胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC），结果发现，miRNA-377抑制剂可促进管腔形成；在心肌缺血大鼠模型中，敲除内源性miRNA-377可直接上调VEGF的表达，进而刺激间质干细胞介导的血管生成，减少心肌纤维化并改善心肌功能。

4 miRNA-101与VEGF/VEGFR 2信号通路

微小 RNA-101（microRNA-101，miRNA-101）在肿瘤中的作用机制成为另一个研究热点，越来越多的研究发现其与血管生成关系密切，并主要负性调节血管内皮细胞生长因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGFC）的表达，对 VEGFR2的磷酸化也有增强作用。Deng等[28]在肝内胆管癌细胞和组织标本中发现，miRNA-101可直接下调VEGFC的表达水平，从而抑制肝内胆管癌细胞的侵袭和迁移。Liu等[29]在肝癌组织和细胞中也发现了类似的结果。Li等[30]在铂耐药胃癌细胞中证实，miRNA-101的表达水平明显下降，并且与VEGFC水平呈负相关，将miRNA-101类似物转染至胃癌细胞后，胃癌细胞的增殖率下降，凋亡率升高。Lei等[31]在体外实验中发现，miRNA-101可直接下调VEGFC的表达，并抑制膀胱癌细胞的侵袭和迁移；细胞增殖实验结果显示，miRNA-101可以提高膀胱癌细胞对顺铂化疗的敏感性。以上3项研究均采用荧光素酶法证实VEGFC是miRNA-101的直接靶点，但有关miRNA-101与血管生成关系的研究仍需进一步完善。Kim等[32]在体外研究中发现miRNA-101对缺氧条件敏感，将外源性miRNA-101转染至HUVEC后，可上调血红素氧化酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的表达，进而促进HIF1A介导的VEGF表达；此外，过表达的miRNA-101还可加强VEGFR2的磷酸化作用，并促进其下游效应蛋白的表达，如FAK、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）、内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK），最终促进内皮细胞增殖、迁移及管腔形成；在下肢缺血小鼠模型中发现，miRNA-101可明显改善缺血下肢血流情况，增加毛细血管数量。Liu等[33]在胃癌细胞和组织标本中发现miRNA-101、miRNA-27b、miRNA-128可抑制VEGFC的表达，并与MVD呈负相关；体外实验发现，三者的表达可减少VEGFC的分泌，进而抑制内皮细胞增殖、迁移以及管腔形成；但3种miRNA之间并未发现协同作用，仍需进一步研究。

5 PDCL 3与VEGF/VEGFR 2信号通路

光导蛋白样蛋白（phosducin-like protein，PhLP）是一种保守型蛋白家族，具有与硫氧还原蛋白相似的结构域，最初被认为是G蛋白信号通路的调节器。该蛋白家族成员包括PhLP1、PhLP2A（又称为PDCL3）、PhLP2B和PhLP3[34]。PDCL3可调节VEGFR2的稳态，并在缺氧情况下促进血管生成。

体外研究发现，作为一种新型蛋白，PDCL3与VEGFR2的稳定性有关，并扮演该受体分子伴侣的角色[35]。无需VEGF配体介导的磷酸化，PDCL3便能与VEGFR2的近膜域结合，通过抑制VEGFR2的泛素化和降解，从而调控其表达量。PDCL3还可以促进VEGF诱导的酪氨酸磷酸化。此外，VEGFR2介导的内皮细胞增殖和毛细血管形成同样需要PDCL3的参与。PDCL3调控了VEGFR2的表达量与功能，并在后续的血管生成中发挥了重要作用。Srinivasan等[36]研究发现，PDCL3位于细胞内质网以及细胞质间隔，主要与细胞内的VEGFR2结合，可协助VEGFR2折叠，再次证实其分子伴侣的作用。体外实验中，通过干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默HUVEC的PDCL3表达后，VEGFR2酪氨酸激酶磷酸化对VEGF配体的敏感性明显下降。在斑马鱼和小鼠实验中，PDCL3同样展现了其促血管生成的生物学意义。另外，缺氧条件能够上调PDCL3的表达，进一步加深了人们对缺氧条件促血管生成机制的了解。然而，PDCL3还可能受其他血管生成因子的调控。有研究在人卵巢上皮癌裸鼠移植瘤模型中发现，贝伐珠单抗组和阿帕替尼组的PDCL3表达量均高于对照组，认为PDCL3可能与抗血管药物的耐药有关[37]。

由于目前肿瘤抗血管治疗产生的耐药限制了其疗效，干扰PDCL3的表达在理论上可能会增加肿瘤患者对抗血管药物的获益，但PDCL3在各类肿瘤中是否异常表达需要进一步研究证实。

6 AIBP与VEGF/VEGFR 2信号通路

载脂蛋白A-I结合蛋白（apoA-I binding protein，AIBP）是应用酵母双杂交技术从人肝脏cDNA文库中筛选的一种分泌蛋白，主要由高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）组成，可与载脂蛋白A-I结合[38-39]。Fang等[40]研究发现，AIBP介导的胆固醇流出可对新生血管进行负性调控。在内皮细胞中发现，AIBP可与HDL协同促进胆固醇流出，抑制了VEGF介导的内皮细胞管腔形成。该研究还发现，胆固醇流出也影响了细胞膜上的脂筏结构，脂筏的破坏阻碍了细胞膜表面VEGFR2的二聚化，使VEGF/VEGFR2信号的传导受到抑制。此外，该信号通路中多种蛋白激酶（如VEGFR2、FAK、ERK1/2、AKT）的磷酸化也部分减弱。将人类 AIBP（human apoA-I binding protein，hAIBP）及斑马鱼 AIBP2（zebrafish apoA-I binding protein 2，zAIBP2）基因转染至HEK293细胞，随后移植入小鼠主动脉环，与对照组相比，hAIBP组和zAIBP2组主动脉环处的血管生成明显受到抑制。体外实验中，研究者运用吗啉代寡核苷酸抑制了斑马鱼胚胎中zAIBP2的表达，发现前段动脉的脂筏数量和新生血管明显增加；而补充了足量的HDL后，zAIBP2的缺失效应得以弥补，胆固醇流出再次加强，前段动脉脂筏数量减少，血管新生受到抑制。Western blot结果证实，zAIBP2的低表达提高了VEGFR2信号通路的磷酸化水平，并且促进了血管生成素-1受体TIE2、VEGFR3、Friend白血病病毒整合素-1（Friend leukemia integration-1，FLI-1）及其他血管生成因子的表达。

在体内外研究中，AIBP能够促进胆固醇流出从而调节脂筏数量以及VEGFR2信号通路，最终调控血管生成。值得注意的是，胆固醇代谢紊乱与恶性肿瘤密切相关[41]，AIBP介导的胆固醇流出能否对肿瘤血管生成进行调控，值得进一步深究。

7 小结和展望

恶性肿瘤的发生发展与血管新生密切相关，抑制血管新生是一种有效的治疗手段。在过去的几十年中，对VEGF/VEGFR2信号通路的体内外研究取得了大量的成果，已有大量抗血管生成药物，如VEGF单克隆抗体贝伐珠单抗和阿柏西普，VEGFR2酪氨酸激酶抑制剂阿帕替尼、索拉非尼、苏尼替尼等已应用于临床，大量Ⅲ期临床试验证实抗血管治疗提高了晚期非小细胞肺癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌患者的无进展生存时间和（或）总生存时间，但仍有一些问题亟须解决：①需发现特异性生物标志物明确抗血管治疗获益人群[42]；②单一抗血管治疗并不理想，需与化疗及其他治疗方案联合[43]；③抗血管治疗数月后发生耐药，机制尚不明确[44]；④部分患者对不良反应无法耐受，最佳药物剂量与时间还需优化[45]；⑤抗血管治疗并非适用于所有实体瘤，也有可能促进病情进展[46]。VEGF/VEGFR2信号通路的调控机制是未来的研究方向，临床研究者仍需对肿瘤血管生成机制进行深入研究，为肿瘤治疗提供新的方向和策略。