5-氮杂- 2’-脱氧胞苷抗肿瘤治疗的研究进展△

李冉浩，魏枫，王玮

内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院内分泌科，内蒙古 包头0140100

目前肿瘤仍是威胁人类健康和生命的一大难题，近年来恶性肿瘤的发病率不断上升，据统计，2012年发展中国家恶性肿瘤患病人数占全球的57%，死亡人数高达全球的65%[1]。近年来，中国恶性肿瘤的发病率和病死率均逐年上升，其治疗仍以手术切除为主，放疗和化疗为辅。尽管近年来医疗诊治水平日益提高，肿瘤的检出率不断提高，肿瘤患者的生存情况得以改善，但80%的肿瘤患者就诊时已属于晚期[2]。因此，了解肿瘤的发生机制，寻找有效的治疗方法是目前临床面临的重要问题。现代医学认为，肿瘤的发生是一个多阶段、多因素和多个异常基因综合作用的过程，其生物学本质是细胞内遗传调控和表观遗传调控的紊乱与失调。DNA甲基化和组蛋白修饰是表观遗传调控的主要方式，其中以DNA甲基化最为常见，即基因的表型受到抑制，表达发生改变，但并不涉及DNA核苷酸序列的变化，而只是部分碱基发生甲基化的修饰。DNA甲基化是一个可以被逆转的过程，通过去甲基化药物可以恢复基因的功能，抑制肿瘤的生长，因此成为肿瘤治疗的新靶点[3]。目前临床上认为5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）的去甲基化作用较为肯定。本文对5-Aza-CdR在细胞系、动物实验和临床试验中的抗肿瘤研究进展作一综述。

1 5-Aza-CdR的生物学活性及作用机制

5-Aza-CdR是DNA甲基化转移酶抑制剂，于1964年被Pliml和Storm首次合成，其中文名称为地西他滨。2006年5-Aza-CdR作为去甲基化药物被美国食品药品管理局（FDA）批准治疗骨髓增生异常综合征、慢性髓系白血病等恶性肿瘤[4]。5-Aza-CdR为白色或类白色晶体状粉末，无味，分子式为C8H12N4O4，分子量为228.21，可在体内外逆转因DNA异常甲基化导致的恶性肿瘤，使因高甲基化而沉默的抑癌基因被激活，导致细胞分化和（或）凋亡，阻止肿瘤进一步发展[5-7]。研究表明，5-Aza-CdR可通过去甲基化作用有效地抑制肿瘤细胞的生长和增殖，降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力，阻滞肿瘤细胞的生长周期，促进肿瘤细胞凋亡，最终抑制肿瘤的发生和发展[8]。随着研究的深入，5-Aza-CdR在动物模型中的应用也获得了成功，并逐步进入临床试验。有关5-Aza-CdR去甲基化对肿瘤的影响已有许多报道，5-Aza-CdR已成功作用于肺腺癌[9]、结肠癌[10]、膀胱癌[11]等。

2 5-Aza-CdR与肿瘤治疗

2.1 甲状腺癌

研究表明，重组人丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制因子A成员5（serpin family A member 5，SERPINA5）的甲基化与BRAF突变有关，而BRAF基因突变会使甲状腺癌的复发风险增加[12]。Lee等[13]应用5-Aza-CdR处理甲状腺癌细胞株（TPC1、WRO82-1和XTC），发现SERPINA5在3种细胞株中均发生了去甲基化，说明5-Aza-CdR可以降低甲状腺癌的复发率，为预测甲状腺癌的复发提供了实验依据。甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）的恶性程度较高，且对化疗和放疗药物高度耐受。Vitale等[14]研究了5-Aza-CdR与抗肿瘤药物依维莫司在人MTC细胞MZ-CRC-1（对依维莫司单独最耐受的细胞系）中的作用。实验分为4组：A组两种药物等剂量（IC50）、B组依维莫司剂量相对较高[依维莫司（IC50）/5-Aza-CdR（IC25）]、C组 5-Aza-CdR剂量相对较高[依维莫司（IC25）/5-Aza-CdR（IC75）]和空白对照组，应用CALCUSYN软件评估药物之间的相互作用，C组中观察到协同作用，而B组中观察到拮抗作用；采用噻唑蓝测定细胞活力，与对照组相比，B组和C组治疗6天后观察到细胞凋亡数均加倍。提示5-Aza-CdR可以逆转化疗药物的耐药性，从而抑制肿瘤细胞的生长，说明5-Aza-CdR在抗肿瘤中不仅单药有效，在联合用药方面也有显著的效果。

2.2 血液病

2.2.1 淋巴瘤Guo等[15]采用5-Aza-CdR对人伯基特淋巴瘤细胞裸鼠进行研究，造模成功后，随机分为实验组（9只）和对照组（9只），采用腹腔注射的给药方式，实验组采用5-Aza-CdR处理，对照组予以0.9%氯化钠溶液，24天后处死裸鼠，实验组抑瘤率为27.98%。将组织切片行逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）、甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific-polymerase chain reaction，MS-PCR）发现，与对照组相比，实验组抑癌基因CHFR mRNA的相对表达量明显升高，甲基化条带明显变暗，同时出现非甲基化条带。提示5-Aza-CdR不仅能够抑制淋巴瘤裸鼠移植瘤的生长，还能够去除抑癌基因CHFR的甲基化状态，使CHFR的功能得以恢复，从而发挥抗肿瘤作用。Wang等[16]采用浓度为1、4、7、10 μmol/L的5-Aza-CdR处理淋巴瘤Raji细胞作为实验组，对照组予以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果发现，随着5-Aza-CdR浓度的升高，细胞凋亡率增加。采用MS-PCR法检测基因表达情况，出现了与动物实验相似的结果，即甲基化条带变暗，同时出现了非甲基化条带，提示5-Aza-CdR可以促进肿瘤细胞凋亡，并可能通过抑制CHFR的甲基化而加速细胞凋亡。Stathis等[17]对非霍奇金淋巴瘤患者应用5-Aza-CdR联合抗肿瘤药物伏立诺他进行了Ⅰ期临床试验，该研究纳入43例患者，其中14例患者采用最大耐受剂量（maximal tolerable dose，MTD）即先用5-Aza-CdR 10 mg（/m2·d）处理，第6～12天改为伏立诺他200 mg/d，另12例患者先用5-Aza-CdR 10 mg（/m2·d）处理，第3～9天改为伏立诺他200 mg/d，其他患者一直采用联合用药。联合组中11例患者治疗4个周期后病情稳定，3例患者可持续生存8个或更多周期；单药组中4例患者发生血小板减少症，2例患者发生中性粒细胞减少症。由于患者例数较少，两种药物的最佳单药剂量仍然未知，但值得肯定的是所有患者均得到了不同程度的获益。

2.2.2 骨髓瘤Atallah等[18]开展了一项有关5-Aza-CdR治疗多发性骨髓瘤的Ⅲ期临床试验，共纳入170例患者，试验组89例，对照组81例。试验组患者接受5-Aza-CdR联合标准治疗方案，对照组患者接受单纯的标准治疗方案，结果发现，试验组患者的缓解率为17%，对照组患者的缓解率为0，前者的平均完全缓解时间为10.3个月，表明5-Aza-CdR可延长多发性骨髓瘤患者的生存时间。

2.3 肺癌

Liu等[9]将人肺腺癌细胞系A549、H838接种于裸鼠体内，分为A组（0.9%氯化钠溶液处理）、B组（500 nmol/L 5-Aza-CdR处理）、C组[500 nmol/L恩替司他（MS-275）处理]、D组（5-Aza-CdR+MS-275处理）。结果显示，与A组相比，B组和D组的DNA甲基化转移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）表达水平降低，Ras相关结构域蛋白1A（Rasassociation domain family protein 1A，RASSF1A）表达水平显著增加、甲基化水平下降，肿瘤体积缩小，提示无论是否有MS-275处理，5-Aza-CdR都可抑制肿瘤生长。Momparler[19]对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者进行了Ⅰ～Ⅱ期临床试验，对未进行过化疗的5例Ⅳ期NSCLC患者静脉输注5-Aza-CdR，剂量为200～660 mg/m2，5例患者的生存时间分别为 4.3、6.7、9.3、15.3和16.0个月，唯一的不良反应是粒细胞减少。该研究结果表明，大剂量输注5-Aza-CdR并未延长患者的生存时间，可能与样本量较小有关。

2.4 消化道肿瘤

2.4.1 胃癌 卞庚等[20]在裸鼠右侧肋部皮下注射0.1 ml胃癌细胞MKN-45悬液，造模成功后随机分为对照组（0.9%氯化钠溶液处理）、5-Aza-CdR组（2 mg/kg 5-Aza-CdR处理）、化疗药物组（1 mg/kg紫杉醇+5 mg/kg氟尿嘧啶处理）、联合组（2 mg/kg 5-Aza-CdR+1 mg/kg紫杉醇+5 mg/kg氟尿嘧啶处理）。3周后处死裸鼠，结果显示，与对照组相比，5-Aza-CdR组和化疗药物组的移植瘤生长速度明显减慢，而联合组的移植瘤生长速度下降最为明显，化疗药物组肿瘤转移相关蛋白波形蛋白（vimentin）的表达水平无明显变化，5-Aza-CdR组vimentin的表达明显下降，联合组vimentin的表达下降更显著。提示5-Aza-CdR可以通过抑制vimentin的表达，抑制MKN-45移植瘤的生长和转移。说明5-Aza-CdR不仅对原发肿瘤具有抑制作用，还具有抵抗肿瘤转移的能力。

2.4.2 肝癌Yuan等[21]以5-Aza-CdR处理的肝癌细胞HepG2作为实验对象，采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测基因的表达量，结果显示，5-Aza-CdR明显激活了抑癌基因PTEN和先天免疫相关基因STAT1的表达，而致癌基因CD44和HSPA4的表达则受到了明显抑制。

2.4.3 胰腺癌Pan等[22]采用抗肿瘤药物大黄素（40 μmol/L）、5-Aza-CdR（1 μmol/L）、大黄素+5-Aza-CdR处理胰腺癌PANC-1细胞株72 h，分别作为A组、B组和C组，对照组采用0.1%二甲基亚砜处理。结果发现，与对照组相比，A组和B组的DNMT1和DNA甲基化转移酶3A（DNA methyltransferase 3A，DNMT3A）表达水平均降低，抑癌基因p16和RASSF1A的甲基化水平呈不同程度下降，蛋白表达均显著增加；而B组较A组更明显，C组上述指标的改变较A组和B组更为显著。提示大黄素联合5-Aza-CdR可通过降低DNMT1和DNMT3A的表达，增强p16、RASSF1A的去甲基化作用，从而发挥抗肿瘤效应。

2.5 泌尿系统肿瘤

2.5.1 前列腺癌McCabe等[23]采用5-Aza-CdR治疗TRAMP前列腺癌小鼠，实验组采用5-Aza-CdR处理，对照组予以等量的0.9%氯化钠溶液，结果显示，实验组的14只小鼠在24周龄时被治愈，而对照组13只小鼠中有7只发展为低分化前列腺癌，与对照组相比，5-Aza-CdR处理可以延长小鼠的生存时间。Chiam等[24]应用0～20 mmol/L 5-Aza-CdR每日和隔日处理人前列腺癌细胞LNCaP，与对照组（无药物处理）相比，每日处理组在所有浓度下均能有效抑制LNCaP细胞增殖，隔日处理组较低剂量5-Aza-CdR的作用强，每日处理组达到上述抑制作用需要的5-Aza-CdR剂量较低。

2.5.2 膀胱癌Bender等[25]应用5-Aza-CdR处理膀胱癌T24细胞接种的裸鼠，发现裸鼠的移植瘤较未处理组明显缩小，表明5-Aza-CdR可减缓肿瘤的生长。单用丝裂霉素C（mitomycin C，MMC）后耐药性的发生是膀胱癌治疗中的难题，且P糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）、多药耐药相关蛋白 1（multidrug resistance associated protein 1，MRP1）的表达增加提示肿瘤患者的预后不良[26]。Zhang等[11]应用不同浓度的5-Aza-CdR和MMC处理膀胱癌T24细胞，结果显示，随着5-Aza-CdR浓度的增加，T24细胞增殖率降低，Pgp、MRP1的表达水平降低。

2.6 妇科肿瘤

2.6.1 卵巢癌 卵巢癌化疗失败的主要原因是卵巢癌细胞对顺铂的敏感性降低[27]。低剂量的5-Aza-CdR虽无直接的抗肿瘤作用，但能通过改变卵巢癌耐药细胞中hMLH1基因的甲基化状态，从而逆转肿瘤对顺铂的耐药，因此低剂量的5-Aza-CdR联合化疗药物可能达到更好的临床治疗效果。2.6.2乳腺癌Kang等[28]应用不同浓度的5-Aza-CdR对乳腺癌细胞MCF-7进行体外培养，结果显示，runt相关转录因子3（runt related transcription factor 3，RUNX3）在MCF-7细胞中表达下调且高度甲基化，经5-Aza-CdR处理，RUNX3的mRNA及蛋白表达水平均升高，且较处理前的细胞，其增殖受到抑制且凋亡率增加，表明5-Aza-CdR可以通过降低RUNX3的高甲基化状态并恢复其表达，抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。在卵巢癌[29]、宫颈癌[30]细胞株中也有相似的研究结果。

3 小结

5-Aza-CdR可以通过去甲基化作用阻滞肿瘤细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞和实体瘤生长，还可以有效抑制肿瘤转移，因其与化疗药物具有协同作用，故联合应用可提高化疗药物的敏感性，延缓肿瘤进展。无论是在细胞水平还是动物实验研究，5-Aza-CdR的抗肿瘤作用均得到了广泛的认可，在其抗肿瘤机制不断被发现的同时，5-Aza-CdR作为抗肿瘤药物也已应用于临床。虽然在大部分临床试验中5-Aza-CdR显示出了抗肿瘤作用，但仍有临床试验发现5-Aza-CdR在发挥去甲基化作用的同时反而促进了肿瘤的发展[31]。5-Aza-CdR的应用还出现了许多药物相关的不良事件，如骨髓压迫、恶心和呕吐等，尤其在用药剂量方面，仍然存在诸多未解决的问题。由于5-Aza-CdR在各类肿瘤患者中的抗肿瘤效应及不良反应不同，其临床应用存在一定的局限性，仍需大量深入的研究进一步证实。