江苏宿迁地区Hp感染及粪便基因检测克拉霉素耐药现状

刘伟 王艳 朱季军 刘云云 王玉欣 王晓燕

摘要：目的  了解江苏宿迁地区幽门螺杆菌（Hp）感染及对克拉霉素的耐药情况。方法  收集2016年10月～2017年10月在宿迁市第一人民医院行14C呼气试验检查的健康体检者的Hp检查结果，随机留取412例受检者的个人资料，并随机留取146例Hp感染者的粪便标本行粪便基因克拉霉素药敏试验，统计Hp感染率，比较相关因素对Hp感染的影响，初步了解Hp克拉霉素耐药情况。结果  共2919例纳入研究，1248例Hp阳性（42.75%），男性人群的Hp感染率为44.89%，高于女性的39.89%（P<0.05），20岁以下人群Hp阳性率最低（35.42%），21～40岁人群感染率最高（45.18%），40岁以上人群随年龄增大感染率有下降趋势，Hp感染与抽烟、饮酒、个人收入及空腹血糖值之间均无明显关系，146例Hp阳性的粪便标本中，137例可成功提取细菌基因组DNA，其中29个样本的PCR产物经BsaⅠ酶切出现两条目的条带，所有样本的PCR产物经MboⅡ酶切后均未被切开。结论  江苏宿迁地区Hp感染率为42.75%，男性人群及年龄在20～40岁感染率高，粪便基因药敏试验显示克拉霉素耐药率高于21.17%，这将为宿迁地区Hp感染防治提供更有力的依据。

关键词：幽门螺杆菌感染;宿迁地区;粪便基因检测;克拉霉素耐药

中图分类号：R378                                     文献标识码：A                                DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.02.026

文章编号：1006-1959（2019）02-0091-04

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。流行病学研究表明，Hp是世界上感染率最高的细菌之一，尤其在发展中国家，严重威胁着人类健康[1]。在我国不同地区，Hp感染率不同，且各年龄阶段Hp感染率也不相同，详细了解各个地区Hp感染状况及易感因素，有助于该地区Hp感染及相关疾病的防治[2]。宿迁地区位于江苏北部，经济相对落后，有关该地区的Hp感染状况，尚无相关研究报道。Hp根除治疗方法较多，在中国大陆地区，含质子泵抑制剂（PPI）、克拉霉素、阿莫西林（或甲硝唑）的标准三联疗法常作为根除一线疗法，但随着Hp对克拉霉素及甲硝唑耐药率的逐年增加，标准三联的根除率在不断减低[3]。马斯特里赫特Ⅳ共识意见提出，当地区克拉霉素耐药率达到15%时，未经敏感性检测的含有PPI+克拉霉素的三联根除治疗方案应当被摒弃[4]。因此，了解一个地区的克拉霉素耐药情况对于指导Hp的根除治疗具有极其重要的意义。本研究中，我们统计了近1年来宿迁地区体检行14C呼气试验人群的Hp感染率和各种相关危险因素对Hp感染率的影响，并留取部分Hp感染者粪便标本行粪便基因克拉霉素耐药分析，进一步了解宿迁地区Hp感染及克拉霉素耐药情况，从而为临床医师根除Hp治疗提供有力的依据。

1资料与方法

1.1一般资料  纳入人群为2016年10月～2017年10月在宿迁市第一人民医院行14C呼气试验的健康体检者，所纳入者均为宿迁籍长期居住人员，受检前至少4周未服用抗生素、抑酸药或铋剂，排除有胃部手术史、孕妇及哺乳期妇女，共计2919例纳入研究，随机留取412例受检者个人资料，包括性别、年龄、抽烟饮酒情况、收入状况及空腹血糖值，并随机留取146例Hp感染者的粪便标本行粪便基因克拉霉素药敏试验。

1.2方法

1.2.1 14C呼气试验检测方法  使用安徽养和医疗器械设备公司生产的YH04E幽门螺旋杆菌检测仪和呼气卡，受检者至少空腹3 h以上，用温开水吞服14C-尿素胶囊后，静坐15 min后向呼气卡中吹气留取样本，卡上指示窗内颜色有蓝色变为白色时完成取样，将卡插入检测仪的进样口，14C-UBT≥100 dpm/mmol CO2时判定为Hp感染。

1.2.2粪便药敏试验方法  ①粪便细菌基因组DNA提取：称取180～220 mg冻存粪便标本，使用粪便DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），按照操作步骤，提取粪便细菌基因组DNA，并通过Nano-Drop300（杭州奥盛仪器有限公司）检测DNA浓度及纯度，通过测定OD260/OD280比值估计DNA的纯度，OD260/OD280>1.8，说明DNA纯度较高，通过琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性，凝胶电泳条带清晰说明无污染。②Hp 23s rRNA基因扩增：第一轮扩增引物为Hp 23s rRNA1835F：5'-GGTCTCAGCAAAGAGTCCCT-3'，2327R：5'-CCCACCAAGCATTGTCCT-3'，长度为493bp，第二轮扩增引物为Hp 23s rRNA 1942F：5'-AGGATGCGTCAGTCGCAAGAT-3'，2308R：5'-CCTGTGGATAACACAGGCCAGT-3'，长度为381bp。PCR反应体系包括：2x mix 15μl+MgCl2 1.2μl+上游引物（F）0.8μl+下游引物（R）0.8μl+模板1μl+灭菌H2O 11.2μl，反应体系中作为模板的基因组DNA浓度在5 μl/ml左右，引物浓度在10 nM。一轮扩增反应条件：95℃预变性2 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，5个循环，4℃变性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸20 s，30个循环，4℃ 5 min。二轮扩增反应条件：95℃预变性2 min，94℃变性20 s，63℃退火20 s，72℃延伸20 s，28个循环，72℃延伸7 min，4℃ 5 min。反应结束后将PCR扩增产物取出，置于4℃冰箱保存备用。琼脂糖凝胶电泳成像检测PCR产物。③PCR产物酶切：使用限制性内切酶对PCR扩增产物进行特异性位点的酶切，BsaⅠ酶（2143）识别位点序列：5-GGTCTC（N）1，3-CCAGAG（N）5，酶切产物长度为208bp和173bp。MboⅡ酶（2142）识别位点序列：5-GAAGA（N）8，3-CTTCT9（N）5，酶切产物长度为191bp和190bp。酶切体系成分包括：10xBuffer 1.5μl+BsaⅠ/MboⅡ 0.5μl+PCR产物5μl+ddH2O 8μl，反应体系轻轻混匀置于37℃恒温水浴锅，孵育过夜，反应产物經2%琼脂糖凝胶电泳观察。④粪便基因组DNA测序验证：所有PCR扩增成功的样本中随机选取66个样本送上海生工测序，测序结果与酶切结果相互比较。

1.3观察指标  统计被纳入研究人群总的Hp感染率，包括不同性别、各年龄段、抽烟与否、饮酒与否、不同收入状态、不同空腹血糖值的Hp阳性率，并比较以上因素对Hp感染的影响。与克拉霉素耐药有关的23s rRNA V区本身不存在BsaⅠ、MboⅡ的酶切位点，若存在耐药突变2143位点上A→G突变、2142位点上A→G或A→C突变，则会出现相应酶切位点，产物会被酶切成不同的两条片段，观察成功提取细菌基因组DNA标本的酶切结果，初步评估Hp克拉霉素耐药情况。

1.4统计学方法  应用SPSS 16.0统计分析软件处理结果。计量资料以（x±s）表示，采用方差分析;计数资料以（%）表示，采用？字2检验或Fisher确切概率法，影响根除结果的相关因素分析采用单因素、多因素回归分析等方法，P<0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1宿迁地区Hp感染现状  2919例健康体检者行14C呼气试验检查，年龄12～81岁，平均年龄（43.79±14.43）岁，Hp感染者共1248例（42.75%），其中男性751例（44.89%），感染率高于女性（？字2=7.300，P=0.007），见表1。

将所有受检者按年龄分组，分别为12～20岁组、21～40岁组、41～60岁组和60岁以上组，与12～20岁组相比，其余各组感染率差异无统计学意义（P>0.05），但Hp感染随年龄变化存在明显变化趋势，其中20岁以下人群感染率较低（35.42%），21～40岁人群感染率最高（45.18%），40岁以上人群随年龄增大Hp感染率有下降趋势，见表2。

2.2 Hp感染的相关因素分析  将412例接受调查问卷的相关结果进行统计分析，发现Hp感染与抽烟、饮酒、个人收入及空腹血糖值之间均无明显关系（P>0.05），见表3。

2.3 Hp对克拉霉素耐药情况  146例粪便标本中有137例细菌基因组DNA提取正常，Hp 23s RNA第二轮扩增结果见图1，29例PCR产物经BsaⅠ酶切后出现两条目的条带，见图2。137例样本PCR产物经MboⅡ酶切后均未被切开。将137例成功提取DNA的标本随机抽取66例PCR产物送上海生工测序，测序结果与酶切结果一致，见图3。

3讨论

本研究显示，2016～2017年江苏宿迁地区Hp感染率为42.75%，2012～2013年江苏东台地区调查结果显示Hp感染率为44.3%[5]，2013～2014年南京的一项健康人群Hp感染状况研究表明[6]，南京地区Hp感染率为43.56%，本地区Hp感染率与江苏省其他地区大致相同。回顾2006年一项江苏苏中地区开展的Hp感染调查研究[7]，结果显示Hp总感染率为62.07%，可见近年来江苏地区Hp感染率有大幅下降。结果显示男性人群Hp感染率高于女性，这与其他地区研究结果一致，2015年“京都全球共识”明确指出Hp感染为一种感染性疾病[8]，通过口-口和粪-口途径在人与人之间传播，这可能是男性感染率较高的主要原因。

当年龄<20岁，Hp感染率较低，随着年龄增长，Hp感染率增加，本研究显示20～40岁人群Hp感染率最高，40岁以上随着年龄增长Hp感染率趋于稳定，并有所下降。李萌辉等统计了天津地区人群的Hp感染情况[9]，发现其感染率随年龄增加呈增加趋势，50岁以上各年龄组间Hp感染分布无明显差异，趋于稳定。李华等分析了浙江杭州地区Hp感染情况[10]，不同年龄段感染率统计中，50～59岁及60～69岁年龄组Hp感染率高于其他年龄段，<20岁人群Hp感染率较低。本研究中<20岁及60岁以上年龄组人群较少，无法更深层次体现20岁以下及60岁以上人群的Hp感染趋势。众多研究表明，Hp感染与家庭收入、饮食卫生、教育程度、家庭聚集、BMI、糖尿病等有关[11，12]。本研究中，我们分析了Hp感染与收入、抽烟、饮酒及空腹血糖值之间关系，差异均无统计学意义（P>0.05），考虑可能与本研究所纳入的样本量相对不足有关。因此，我们需要更大规模，年龄分布更平均的流行病学调查研究，从而更准确的反应各个年龄段之间Hp感染率的差异及Hp感染与其它因素之间的关系，给Hp防治提供更准确的指导。

目前抗菌药物的广泛耐药、Hp菌株毒力改变、CYP2C19基因多态性及患者依从性差等多种因素，是导致Hp根除治疗失败的主要原因[13]，其中抗生素耐药是根除率下降的首要因素。现阶段虽然四环素、呋喃唑酮耐药率低，但临床难以获得，克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、左氧氟沙星仍然是根除Hp的主要抗生素。Hp 23s rRNA的V区基因的点突变（最常见的是A2143G，其次为A2142G及A2142C）可以降低克拉霉素的亲和力，导致抗生素耐药，临床上克拉霉素的耐药80%～90%是由基因的突变导致的[14]。本研究中我们仅分析了粪便基因組2143及2142位点的突变情况，共收集146例Hp感染者的粪便标本，其中137例标本粪便基因提取成功，具有较高的成功提取率，137例PCR产物中有29例可被BsaⅠ酶切，而无一例被MboⅡ酶，由此可推断宿迁地区粪便基因克拉霉素耐药率高于21.17%。Masstricht-4共识指出[4]，在克拉霉素耐药率>15%的地区，根除Hp的一线方案首先推荐铋剂四联方案，本研究中宿迁地区克拉霉素耐药率>20%，因此，在宿迁地区我们应该摒弃标准三联疗法，而选择含铋剂的四联疗法作为首选根除方案。在进一步的研究中，我们也将根据粪便基因克拉霉素耐药结果指导临床Hp根除治疗。

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收稿日期：2018-9-17;修回日期：2018-9-27

编辑/杨倩