淋球菌对大观霉素耐药机制的研究进展

孙思 刘兰兰 佟立峰 吕纯芳 罗珍胄,* 陈绍椿 陈祥生

(1 深圳市南山区慢性病防治院，深圳 518000；2 中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所，南京 210042)

淋球菌(Neisseria gonorrhoeae, NG)是全球最常见的性病病原体之一，由其所致的淋病在全球范围内流行。淋病能导致泌尿生殖系统化脓性临床表现，如果未及时治疗，将可能向组织入侵，导致睾丸炎、附睾炎、骨盆炎症或输卵管炎，造成女性不孕、异位妊娠、胎膜早破和男性不育等后遗症；若全身性扩散，将导致关节炎、腱鞘炎或皮炎等。除此之外，淋病还将加大艾滋病毒感染风险[1]。

淋病的治疗药物是抗生素，但由于抗生素的滥用，加大了淋球菌对抗生素的选择压力，同时淋球菌之间易发生耐药基因的水平转移，由此导致淋球菌先后对磺胺类抗生素、青霉素、四环素、环丙沙星和氧氟沙星普遍耐药，同时也对目前推荐治疗药物(头孢曲松、头孢克肟、大观霉素)表现出敏感性下降的趋势[1]。大观霉素作为多数国家治疗淋病的推荐药物之一，在控制淋病的流行、预防淋病的后遗症以及降低艾滋病感染风险等方面起到重要作用，但部分国家和地区已有报道对大观霉素耐药的淋球菌菌株。因此，研究淋球菌对大观霉素的耐药机制刻不容缓。

本文将从淋病的流行现状、淋球菌的耐药现状、大观霉素在目前淋病治疗方案中的作用、淋球菌对大观霉素耐药机制等方面进行综述。

1 淋病的流行现状和淋球菌的耐药现状

1.1 淋病的流行现状

2012年，世界卫生组织(World Health Organization,WHO)估计全世界每年有7800万人感染淋病，其中西太平洋区域3520万人、东南亚区域1140万人、非洲区域1140万人。另外，在医疗资源缺乏的区域，由于检测手段的缺乏，病例报告的不完整，可能使其报告的病例数远低于真实情况[2]。

淋病在美国是第二大常见性病，2017年美国报告病例数约为55.56万，发病率为171.9/10万，其中南部地区发病率最高，为194.0/10万[3]。2017年，英国新发淋病患者数目超过44500例，并且大部分病患的年龄低于25岁[4]。韩国卫生和福利部估计韩国淋病的年发病率为100/10万[5]。

在我国，1953年淋病早期患者已近绝迹，1960年基本上完成了晚期患者的普查普治，1964年已基本消失淋病[6]。但我国在1991—1999年淋病的发病率逐渐上升至最高峰，达到22.78/10万，之后经过一系列有效的防治措施，淋病的发病率在1999—2006年总体呈现下降趋势，只是在2004年出现一个小的发病高峰(17.34/10万)[6]，发病率目前最低的年份是2012年(6.78/10万)，近几年的发病率变化不大。目前淋病的上报例数居于性病中的第二位，全国甲乙类法定传染病报告发病数的第5位，2016年的上报例数是115024，发病率为8.36/10万，2017年上报例数为138855，发病率为10.06/10万[7]。

1.2 淋球菌的耐药现状

淋病在各国受到重视，不仅在于其发患者数之多，更在于淋球菌对治疗药物的耐药性。迄今为止，淋球菌已先后对推荐用于治疗淋病的抗生素(磺胺类抗生素、青霉素、四环素、环丙沙星、氧氟沙星)产生广泛耐药[1]。

其他各国(或地区)淋球菌耐药监测结果显示淋球菌对青霉素、四环素和环丙沙星的耐药率非常之高，对阿奇霉素也表现出一定的耐药性，同时对头孢类抗生素、大观霉素的敏感性近年来都有所下降。对PubMed近10年的文献统计，其他各国(或地区)淋球菌对青霉素耐药率范围为0.8%～100%[5,8]，四环素耐药率范围为6%～100%[9-10]，环丙沙星耐药率范围为2%～100%[9-10]，阿奇霉素耐药率范围为0.17%～25%[11-12]，大观霉素耐药率范围为0.6%～11.6%[13-14]，头孢曲松的耐药率范围为0.4%～1.6%[15-16]，其低敏率范围为1.1%～55.8%[17-18]。

我国各地区已发表的数据显示，淋球菌对青霉素、四环素和环丙沙星的耐药率非常之高，对阿奇霉素也表现出一定的耐药性，同时对头孢类抗生素、大观霉素的敏感性近年来都有所下降。近7年国内文献显示，我国各地区淋球菌对青霉素的耐药率范围为51.16%～98.9%，产青霉素酶淋球菌(penicillinase-producingNeisseria gonorrhoeae, PPNG)的百分率范围为13.73%～42.41%[19-22]；四环素耐药率范围为57.7%～100%，抗四环素淋球菌(tetracyclineresistantNeisseria gonorrhoeae, TRNG)百分率范围为12.5%～66.84%[19,22-24]；环丙沙星耐药率范围为39.83%～100%，其高度耐药率范围为42%～52.3%[25-27]；阿奇霉素耐药率范围为3.1%～29.9%[28-29]；大观霉素耐药率范围为0.13%～6.25%[30-31]；头孢曲松耐药率范围为0.5%～4.2%，其低敏率范围为1.85%～12.2%[32-33]。广东、河南和贵州检出多重耐药的淋球菌[28,34-35]。

2 大观霉素在淋病治疗方案中的作用

大观霉素作为氨基糖苷类抗生素，能与16S rRNA相互作用，从而在肽链延长的过程中，阻遏延伸因子(elongation factor G, EF-G)将肽基tRNA从A位催化转运至P位，抑制蛋白的翻译。简而言之，大观霉素结合细菌的30S核糖体亚基，从而抑制蛋白的翻译，产生抑菌的作用[36]。

在20世纪40年代，青霉素是治疗淋病的主要药物，但到了20世纪60年代早期，淋球菌中出现了产青霉素酶淋球菌(penicillinase-producingNeisseria gonorrhoeae, PPNG)，而青霉素无法治愈罹患该种淋病的患者。在这种情况下，大观霉素作为特效药用于治疗这些患者。之后，随着PPNG的流行率超过5%，大观霉素于1981年在驻韩美军中开始作为一线药物用于淋病治疗[37]。

在大观霉素作为特效药用于淋病治疗后的1967年，荷兰首次报道了在青霉素敏感的淋球菌中出现了大观霉素抗性。另外，1981年在菲律宾出现了同时耐青霉素和大观霉素的淋球菌。同时，1983年在英国伦敦出现了许多耐大观霉素淋球菌。并且，1985年驻韩美军中大观霉素治疗淋病的临床失败率达到8.2%。随后，全球范围便不再推荐用于治疗淋病的单一疗法[37]。

目前，淋球菌对大观霉素的耐药，特别是高水平耐药，在全球非常少见。但如果将其作为一线治疗药物治疗淋病，可能会导致淋球菌对其耐药率的升高。大观霉素对口咽部淋病的治疗效果不佳，使得其应用范围小于头孢类抗生素，特别是在男同性恋人群中，大观霉素的有效率更低。所以，许多国家和地区不将大观霉素作为治疗淋病首选抗生素，特别是不用于口咽部淋病的治疗，但可用于头孢类抗生素治疗失败的淋病患者的治疗[38]。

各国或地区的淋病治疗方案中，头孢曲松是大多数国家所使用的首选治疗药物，但是，由于淋球菌对头孢曲松的敏感性下降，特别是日本等出现对头孢曲松耐药的淋球菌，提示未来使用头孢曲松治疗淋病的严峻性[1]。大观霉素虽然不作为治疗淋病的首选药物，但它在许多国家或地区的方案中，仍然作为一个替代治疗药物发挥作用。

韩国在2002—2006年，使用大观霉素对大部分的淋病患者进行治疗，并且2009—2012年的情况也与之类似。虽然韩国普遍使用大观霉素治疗淋病，但淋球菌对大观霉素的敏感性依旧很高，目前大观霉素在韩国作为推荐抗生素用于淋病的治疗[5]。其他国家和地区淋病治疗方案中大观霉素的使用情况见表1。

3 淋球菌对大观霉素耐药机制

对于淋球菌，大观霉素是一种外界刺激因子，当大观霉素作用于淋球菌时，将导致淋球菌产生一系列的细胞反应，引起淋球菌对环境适应性的改变和蛋白表达水平的变化，这些变化也在一定程度上促进淋球菌对大观霉素产生耐药。淋球菌对大观霉素耐药的产生机制可以归纳为以下几类：①抗生素的酶解或修饰；②靶标的修饰或保护，以降低其与抗生素的亲和性[37]。

3.1 淋球菌对大观霉素的反应

3.1.1 淋球菌对抗生素环境的适应性

一般而言，在有相应抗生素的体内和体外环境中，耐药细菌相对于敏感细菌更有竞争优势，而在没有相应抗生素的环境中，耐药细菌的适应性普遍比敏感细菌低。但是，耐药淋球菌(resistantNeisseria gonorrhoeae, R-NG)相对于敏感淋球菌(spectinomycin sensitiveNeisseria gonorrhoeae, S-NG)，其适应性并不降低，原因在于mtrCDE外排泵操纵子的去阻遏作用[37]。

在一个BALB/c雌性小鼠下生殖道感染模型中，mtrD或mtrE的无效突变(null mutation)导致MtrCDE外排泵功能丧失，使得淋球菌持续感染的能力降低，这可能是由于细菌无法通过MtrCDE外排泵排出来源于宿主的疏水剂。此外，mtrR作为mtrCDE阻遏蛋白MtrR的基因，对它的无效突变将导致mtrCDE的过表达，从而使得R-NG在体内环境中的适应性提高。与之相反，对mtrA(mtrCDE的激活蛋白MtrA的基因)的无效突变，导致mtrCDE诱导性过表达的功能丧失，使得R-NG在体内环境中的适应性降低[45]。

表1 各国(地区)淋病治疗方案中大观霉素的使用情况Tab. 1 Application of spectinomycin for treatment of gonorrhea in different countries

另外，由于抗生素的广泛使用，由此造成的选择压力使得某些R-NG相对于S-NG在体外和体内环境中具有更好的适应性。再者，细菌的补偿突变、稳定突变和修复突变等特性能在保持其抗生素耐药性的同时维持其在体内和体外环境的适应性。淋球菌的MtrCDE外排泵的功能和外界环境中抗生素的选择压力，使得青霉素、四环素、氟喹诺酮类药物不用于治疗淋病的多年之后，全球范围内仍然有相当比例的相关R-NG流行[46]。

目前没有发现淋球菌对大观霉素的耐药机制中包含了MtrCDE外排泵，所以自20世纪60年代用于淋病的治疗以来，虽然出现了对大观霉素耐药的淋球菌，但在不推荐作为一线治疗淋病药物之后，淋球菌对大观霉素的敏感性得到恢复。

3.1.2 大观霉素引起淋球菌的蛋白表达水平变化

大观霉素进入淋球菌胞质会破坏细胞膜的完整性[47]。Nabu等[36]对大观霉素耐药菌株(spectinomycin resistantNeisseria gonorrhoeae, SR-NG)和敏感菌株(spectinomycin sensitiveNeisseria gonorrhoeae, SS-NG)分别在无抗生素和低于大观霉素最低抑菌浓度(subminimum-inhibitory-concentration, subMIC)的条件下所表达蛋白的水平进行比较，探索了大观霉素和淋球菌相互作用时，淋球菌的蛋白组学图谱。

研究发现，不管是SR-NG还是SS-NG，在subMIC的条件下，Rmp、DLDH、MQO、L7/L12、谷氨酸脱氢酶和过氧化物还原酶的表达均上升，氨基酸ABC转运器底物结合蛋白(amino acid ATP binding cassette transporter substrate-binding protein,aa-SBP)的表达降低。Rmp属于OmpA家族，是淋球菌主要的外膜蛋白组分之一，在淋球菌中起到维持细胞膜完整性的功能；DLDH和MQO参与了细菌的新陈代谢，它们表达的增高可能反应了淋球菌在不利于其生长的环境中为了维持其新陈代谢形成的适应性表现；谷氨酸脱氢酶和过氧化物还原酶参与细菌应对环境因素诱导产生的氧化应激的抵抗机制；L7/L12在蛋白合成以及EF-G功能实现的过程中发挥了重要的作用，其表达的上调可能是淋球菌为了克服蛋白合成抑制剂对翻译抑制的补偿机制；ABC转运器作为大观霉素进入的孔道，aa-SBP表达的减少，起到抑制大观霉素进入细胞质的作用。而在无大观霉素的情况下，SR-NG相对于SS-NG，其EF-Tu和EF-Ts的表达上调，起到促进蛋白翻译的作用[36]。淋球菌对大观霉素引起的蛋白表达的水平变化，在一定程度上反应了淋球菌对外界环境刺激因子的适应性变化。

3.2 药物失活

近年研究发现，革兰阴性菌中的腺苷转移酶和磷酸转移酶可使大观霉素失活，从而导致细菌对大观霉素耐药。其中腺苷转移酶有两组，分别是ANT(3'')和ANT(9)。ANT(3'')是最常见的腺苷转移酶，编码它们的基因通常称为aadA，目前至少有22种相关的基因，其以基因盒的形式嵌入整合子、质粒和转座子，广泛存在于革兰阴性菌中；ANT(9)分为两种，分别是ANT(9)-Ia和ANT(9)-Ib，编码它们的基因也被称为ant(9)-Ia和ant(9)-Ib，前者首先发现于金黄色葡萄球菌中，后者发现于粪肠球菌。磷酸转移酶APH(9)目前发现有两种，分别为APH(9)-Ⅰa和APH(9)-Ⅰb，前者发现嗜肺军团菌，在氨基糖苷类抗生素中，只与大观霉素结合[47]。

3.3 药物作用靶点的改变

大观霉素的作用靶点是16S rRNA，其34螺旋区域中C1192U的点突变会导致淋球菌对大观霉素高水平的耐药[48]。另外，30S核糖体蛋白S5的21～25位氨基酸形成的环形结构，能与16S rRNA的34螺旋区域结合，也参与到大观霉素与核糖体的结合，该蛋白Val25的缺失和K26E的改变会导致淋球菌对大观霉素高水平耐药[49]，T24P的改变也会导致淋球菌对大观霉素低水平耐药[50]，可能是由于S5的改变扰乱了大观霉素与16S rRNA的结合，导致淋球菌对大观霉素耐药。

4 展望

淋病作为常见性病之一，其病原体淋球菌所表现出的抗生素耐药性一直被各国重视，并且各国政府和组织长期监测淋球菌对相关抗生素的耐药率。对抗生素耐药机制的研究，特别是对相关耐药基因的研究，能优化耐药监测的手段，指导精准治疗，如检测相关耐药基因，相对于琼脂糖稀释法，能极大地缩短监测的时间和减少监测的成本，及早知晓耐药情况，从而指导精准用药，能在一定程度上缓解淋球菌对抗生素耐药的严峻形势。另外，阐明淋球菌对抗生素的耐药机制，有助于针对性地开发新药，同时指导药物的联合治疗。淋球菌对大观霉素的耐药机制中不包括MtrCDE外排泵，对大观霉素耐药的淋球菌，在外界环境中其适应性相对于S-NG低。如果谨慎使用大观霉素，能使淋球菌长期保持对大观霉素敏感性，为新药的研发或其他治疗手段的发现提供更充足的时间。