环孢菌素A菌渣无害化减量化技术研究

王欣荣 张雪霞 褚以文 郑智慧 苟小军 路新华 王勇军

（1 抗生素研究与再评价四川省重点实验室，四川抗菌素工业研究所，成都 610052；2 华北制药集团新药研究开发有限责任公司，石家庄 050015)

菌渣是产生于微生物药物提取过程中的工业废弃物，主要含有已灭活的菌丝体、残余培养基、微生物代谢产物、部分残留效价，以及提取时加入的絮凝剂、助滤剂等成分。微生物素发酵产生的菌渣中抗菌素残留较高，如头孢菌素C在菌渣中的残留约2～2.5mg/g，青霉素在菌渣中的残留约1～2mg/g，红霉素在菌渣中的残留约0.2～0.9mg/g，环孢菌素在菌渣中的残留约0.5～2mg/g，环孢菌素在菌渣中的残留约0.1～0.4mg/g，这些残留物最终都会进入环境中，日积月累可能会导致微生物逐渐产生耐药性和其它未知的环境风险，2008年被列入《国家危险废物目录》[1]。现有菌渣无害化减量化处置技术如焚烧、填理以及制造肥料和饲料等普遍存在成本高、二次污染、残留药物积累等负面效应和隐患[2]。我国已经成为全球最大的抗生素原料药生产国和出口国，原料药产量已占全球总产量80%，其中出口占到全世界原料药市场的70%以上。2012年全国抗生素产量约14万吨，相应产生菌渣超过150万吨，因此探讨菌渣无害化、减量化处理显得尤为重要[3]。

本研究以环孢菌素菌渣作为处理对象，研究采用多种嗜热微生物进行无害化、减量化处理，实现环孢菌素生产过程中的菌渣减量排放和基本去除环孢菌素残留。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

嗜热微生物1#：厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus mongoliensisSIIA-1501a)、嗜热微生物2#：土芽孢杆菌(Geobacillussp. SIIA-1501g)和极端嗜热菌3#：Calditerricola yamamuraeSIIA-1501c，本研究组保藏。

1.1.2 培养基及培养条件

LB平板及斜面培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物8，氯化钠8，琼脂16，pH自然。

极端嗜热菌YPG改性平板及斜面培养基(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，磷酸氢二钾2，自来水配制，pH7.2～7.4。

LB种子培养基(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，氯化钠8，自来水配制，pH6.8～7.0。

极端嗜热菌种子培养基(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，氯化钠8，磷酸氢二钾2，自来水配制，pH6.8～7.0。

LB发酵培养基(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，氯化钠8，自来水配制，pH6.8～7.0。

极端嗜热菌发酵培养(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，氯化钠8，磷酸氢二钾2，自来水配制，pH6.8～7.0。

1.1.3 试剂与仪器

试剂：试剂均为国产分析纯，环孢菌素对照品购自美国药典委员会。

仪器：立式蒸气压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；Agilent technologies1200高效液相色谱仪；摇床(美国NBS)；发酵槽，200L微生物发酵罐系统(华北制药工程装备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养方法

培养温度：厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus mongoliensisSIIA-1501a)，培养温度55℃，培养基为LB；嗜热土芽孢杆菌(Geobacillussp. SIIA-1501g)，培养温度65～70℃，培养基为LB；极端嗜热菌(Calditerricola yamamuraeSIIA-1501c)，培养温度75℃。

斜面及平板培养方法：无菌环取菌种涂布于培养基上，培养3～5d。

摇瓶种子培养：分别从各菌株斜面上刮菌苔接种于种子培养基中，培养1～2d，摇床转速220r/min。待各菌液A600＞1.5，并瓶。并瓶后的种子液接种于发酵罐。

发酵罐培养：200L发酵罐内装150L发酵培养基,接种量0.1%～0.5%(V/V)，发酵罐转速100～200r/min，通气量1:0.1～0.3，A600＞1.5终止培养。菌剂成品发酵液直接分装10kg/桶。

1.2.2 菌渣的堆肥处理

试验组：取环孢菌素菌渣，加自来水调成含水量50%～65%，加入0.1%菌剂(W/W)，用铲车翻拌均匀，通气量：0.1vvm。每隔3h测量1次堆心温度，温度超过对应嗜热菌的上限翻抛一次物料。当一个处理阶段后期温度不再升高后，加入下一种菌剂(先加厌氧芽孢杆菌：菌剂A，然后是嗜热地芽孢杆菌：菌剂B，最后加入极端嗜热菌：菌剂C)。其中厌氧芽孢杆菌处理时温度不能超过65℃，嗜热地芽孢杆菌不超过80℃，而极端嗜热菌不超过105℃。

空白对照组：取环孢菌素菌渣，加自来水调成含水量50%～65%，用铲车翻拌均匀，通气量：0.1vvm。每隔3h测量1次堆心温度。

1.2.3 环孢菌素效价分析方法[4]

高效液相色谱系统为Agilent1200，色谱柱为C18反相柱(250mm×4.6mm, 5μm)；流动相为乙腈:水=80:20；柱温70℃；检测波长210nm；流速1.5mL/min；进样量20μL。

1.2.4 碳氮磷钾分析[5]

按照有机肥料标准NY525-2012测定全碳、全磷、全钾和全氮的含量。

2 结果

2.1 堆肥处理过程中的各项指标变化情况

堆肥过程中的温度变化是堆体内微生物活性变化的重要反应。堆体中的水分不仅可以作为微生物代谢和生理活动所需营养物质的载体，还可以蒸发带走热量，调节堆体温度。微生物在生长繁殖过程中分解和利用残存蛋白质、糖、氨基酸、无机盐和其它有机物时放出热量使堆体温度升高含水量减少，堆体重量减少，环孢菌素残留减少。空白对照组具体指标见表1，试验组见表2。

从表1可知，处理过程中，由于只有环境微生物作用，生产过程漫长，堆心最高温度为62.6℃。菌渣经过45d自然堆肥，环孢菌素菌渣减量40%以上，废渣中环孢菌素残留为300mg/L以上。

从表2可知，环孢菌素菌渣经过厌氧芽孢杆菌堆肥处理，第2天温度达到接近50℃，第7天温度开始降低，说明该菌生长代谢开始减速。第8天接种嗜热地芽孢杆菌，堆体迅速升温，到第13天生长代谢开始减速。第14天接种极端嗜热菌，堆心温度最高到达105.6℃。在整个过程中，从第2天起，菌渣中的主要菌群已变为接种菌株，优势菌群依次为：1#、 2#和3#，表明菌渣的减量变化因这3种菌的活动引起的。

表1 试验组堆肥过程各指标变化情况Tab. 1 The course of batch culture (n=5)

表2 试验组堆肥过程各指标变化情况Tab. 2 The course of batch culture (n=5)

经过3周的新工艺处理，环孢菌素菌渣减量80%以上，废渣中环孢菌素残留去除率近99%。经过处理的菌渣，环孢菌素A的残留低于10mg/L，进入环境后，环孢菌素A的残留远低于其作用微生物的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)(256～512mg/L)[8]，已较难以引起耐药性的产生，且环孢菌素A通常情况不作为抗生素使用，因而已不具有环境危害性。

2.2 总氮、总磷和总钾的变化

堆肥产热本质上是微生物新陈代谢的过程，有机物在此过程中被不断分解，并以NH3、H2O、CO2等形式挥发损失，造成氮元素和碳元素绝对量及总干物质质量逐渐减少，并且碳的消耗速率快于氮源的消耗，堆肥结束时，物料中的磷钾等养分相对含量高于原始物料，含水率逐步下降[6]。在本试验中引入了超高温菌，大部分氮源也被水解以NH3的形式挥发，因此在整个处理过程中，物料的C/N呈现一个先下降后回升的过程，见图1。这是因为中温菌菌消耗有机物，使碳源消耗以二氧化碳的形式释放，物料的C/N下降；后期菌渣在超高温菌的作用下，菌渣温度进一步升高，使得NH3挥发，物料的C/N下降。最后的剩余的物料绝大部分碳源和氮源被消耗，残留物主要为磷钾等成分。

3 结论

图1 堆肥过程中C/N的变化Fig. 1 The change of C/N in the composting process

环孢菌素菌渣依次经过厌氧芽孢杆菌堆肥处理5～8d，嗜热地芽孢杆菌堆肥处理4～7d和极端嗜热菌堆肥处理4～6d，环孢菌素菌渣减量80%以上，废渣中环孢菌素残留去除率近99%。常用的堆肥处理菌渣方式是多菌混合处理，弊端在于每种菌体需要的生长温度不一样，而且存在相互抑制的现象，并且周期达到40d，药物残留高。本工艺分阶段补入不同细菌，生长温度逐步提高，每种菌都能够最大限度发挥其生理功能，前一步菌体死亡后又成为下一步菌的营养。最后加入超高温嗜热菌(Calditerricola yamamurae)使得堆肥温度达到100℃以上，消耗有机质的同时又使绝大部分NH3得以释放。由于雷帕霉素、他克莫司、霉酚酸和咪唑立宾等菌渣性质与环孢菌素A菌渣类似，可以研究将本工艺用于这些菌渣的无害化和减量化处理。

在早期，抗生素菌渣一直被作为工业废弃物而丢弃。为了有效利用抗生素菌渣，从20世纪50年代以来，抗生素菌渣被广泛用作动物蛋白饲料和饲料药用添加剂。但是其中残留的抗生素会在动物体内富集，并通过泌乳、产蛋而进入奶、蛋中，进而对人类产生毒、副作用，使人体内的致病菌产生抗药性。2002年2月，农业部、卫生部、国家食品药品监督管理局发布176号公告，禁止抗生素菌渣在饲料和动物饮用水中使用[7]，大部分抗生素生产厂无力处理生产过程产生的大量菌渣，以每吨数千元的代价交由第三方处理。采用三联菌处理环孢菌素菌渣，实现了无害化和减量化，废渣中环孢菌素残留基本去除，经处理后的残渣含有丰富的磷钾等成分，且没有其它危险废物特性，可进一步探讨用于生产有机肥，具备较好的环境效益和社会效益。