补阳还五汤对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠血脑屏障保护作用的研究

刘建春 ，张红珍 ，郭文娟 ，柴 智 ，尉杰忠 ，于婧文 ，肖保国 ，马存根 ，

（1.山西中医药大学神经生物学研究中心，山西晋中030619； 2.山西大同大学脑科学研究所，山西大同 037009；3.复旦大学附属华山医院神经病学研究所，上海200025）

多发性硬化（Multiple sclerosis，MS）是一种发生于中枢神经系统（CNS）的自身免疫性疾病［1］，其主要病理特征为髓鞘脱失、轴突变性及炎性细胞浸润。现代医学对MS的治疗手段主要包括抗炎和免疫调节两方面，然而MS病程迁延、病情反复发作，多不能得到有效的控制，且有些药物不良反应较大［1-2］。中医药在治疗MS方面以多靶点、整体调节为切入点，可能比单一作用靶点的西药更具优势［3］。在临床上，应用中医药的方法治疗MS一方面可改善患者临床症状、减缓疾病的复发，另一方面还可减少激素不良反应等［4］。

中医认为，MS基本病机是本虚标实，血瘀是其中较为特殊的一个证候要素［5］。气虚血瘀证为常见证型之一，治疗应以补气，活血，祛痰、湿、瘀，通络为主。清代著名医家王清任所创的补阳还五汤（BYHWD）是益气活血的代表方剂，具有补气活血通络之功效，由生黄芪四两、当归尾二钱，赤芍一钱半，川芎一钱，地龙一钱，桃仁一钱，红花一钱组成［6-8］。课题组前期研究发现BYHWD治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）可明显改善临床症状，抑制炎症反应，调节免疫［9］。本研究以 MS的经典动物模型EAE小鼠为研究对象，进一步探讨补阳还五汤在疾病潜伏期、发病高峰期、疾病缓解期这3个时间点对EAE的血脑屏障（BBB）保护的机制，以期为临床有效防治多发性硬化等神经系统自身免疫性疾病提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级C57BL/6雌性小鼠，8～10 w龄，共36只，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2016-0006］。实验前小鼠自由饮食喂养1 w，饲养环境为25℃左右的无病原菌清洁级动物房。

1.1.2 实验药物 补阳还五汤为《医林改错》的原方剂量，药材购自北京同仁堂药店。弗氏佐剂（Freund，sAdjuvant，Complete） 购自美国 Sigma 公司；上海强耀生物科技有限公司合成的MOG 35-55多肽（myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide）；Tuberculosis bacilli（TB）购自美国DIFCO公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自BioVision。ZO-1，Occludin均购自武汉三鹰生物技术有限公司。凝胶电泳设备，北京六一仪器厂产品，凝胶成像分析仪购自Bio-Rad，冰冻LEICA切片机，CM1950，购自德国LEICA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 EAE小鼠模型建立 分别称取12 mg TB加入2 mL完全弗氏佐剂，称取10 mg MOG35-55加入2 mL生理盐水中；采用自制的针管混合器来回反复推动使两种溶液充分混合，制成油包水样乳白色抗原乳剂。每只小鼠分4点皮下注射抗原乳剂0.1 mL，注射位置在背侧腰骶膨大处背部中线两侧［10］。将免疫当天记为免疫后第0天。在免疫当日和免疫后第2天，分别给每只小鼠腹腔注射百日咳毒素（PTX）300 ng。免疫动物开始相继出现临床症状是在免疫后的第10天左右，在14～17 d进入高峰期，本次实验小鼠全部发病，且无死亡［11］。

1.2.2 补阳还五汤的制备 药物按常规中药煎煮方法，药物在水中浸泡2 h，煎煮1 h，纱布过滤，渣滓再加适量水煎煮30 min，过滤，二次滤液合并，静置过夜；次日将药液沉淀过滤掉，将滤液浓缩至80 mL，相当于生药2 g/mL，常温下冷却，分装，4℃冷藏备用。

1.2.3 动物分组及用药 应用随机数字表按体质量分层，将36只8～10 w龄雌性C57BL/6小鼠随机分为EAE组、BYHWD组，每组18只。每组小鼠于免疫后第3天开始灌胃给药，EAE组每只小鼠灌胃生理盐水500 μL/d，BYHWD组每只小鼠予以BYHWD 500 μL/d，持续给药至免疫 28 d。

1.2.4 EAE临床症状评分 采用国际通用的5分法［12］，在免疫后第0天开始隔天定时观察及评估实验小鼠的症状，评估标准为：无任何临床症状记0分；轻度步态笨拙，尾部张力消失记 1分；步态蹒跚，单侧后下肢无力，被动翻身后仍可以复位记2分；双后肢瘫痪，但给予刺激后可以挪动，被动翻身后不能恢复记3分；前肢和双侧后肢瘫痪记4分；濒临死亡或死亡记5分。症状介于两个评分标准之间，以±0.5 分计。

1.2.5 标本采集 将免疫后第9天记为疾病潜伏期，第17天记为发病高峰期，第28天记为缓解期。在免疫后第9天、第17天、第28天3个不同时间点分别随机取EAE组和BYHWD组6只小鼠，采用 10%水合氯醛（0.2 mL/只）腹腔注射麻醉，每组取3只推注PBS进行心脏灌注，同时在冰上快速取小鼠脊髓和脑组织，冰上裂解，4℃离心提取蛋白，冻存。各组其余3只小鼠推注PBS至肝脏发白，再推注4%多聚甲醛进行体内组织固定。然后分离脊髓和脑，制作冷冻切片，冰切厚度10 μm，进行固蓝染色和HE染色。

1.2.6 HE染色 将脊髓冰冻切片在蒸馏水中浸润，按照说明书在切片上分别滴加苏木精和伊红染色，梯度乙醇脱水，70%乙醇中 30 s，80%乙醇中 30 s，90%乙醇中 30 s，95%乙醇中 30 s，100%乙醇中 1 min，100%乙醇中 2 min；二甲苯透明，用中性树胶封片，镜检，拍照。

1.2.7 固蓝染色 取脊髓切片于 95% 乙醇中浸泡，按照说明书的操作步骤，将切片浸于固蓝液中，57℃ 孵育24 h，分别经过乙醇溶液、去离子水、0.05%碳酸锂浸洗直至能够清晰辨别灰质与白质，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片，光镜下观察，拍照。

1.2.8 Western Blot 分别提取脊髓和脑组织蛋白，蛋白定量后，加入Buffer煮蛋白，用微量加样器加入40 μg煮好的蛋白样品。用 10%SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白。电泳完毕后，湿转到硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗一抗ZO-1（1∶500）、Occludin（1∶1000）、GADPH（1∶1000），4℃过夜；次日洗涤后，用封闭液稀释相应的HRP 标记二抗（1∶50 000）稀释，使 PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，37℃摇床室温孵育2 h。洗膜后进行化学发光反应，用Bio-RAD凝胶成像仪检测条带，用Band Scan分析灰度值与内参GAPDH的灰度值比值比较，并进行统计学分析。

1.3 统计学方法

采用Graph Pad Prism5.0统计分析软件进行数据处理，Western blot灰度值采用均数±标准差（±s）表示，两两比较使用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EAE组和BYHWD组临床症状比较

EAE组小鼠自免疫后第9天起逐步发病，精神萎靡、食欲减退，平均起病时间（10.6±1.32）d，平均最高临床评分为（3.4±0.22）分。免疫后 17 d 发展为臀部拖地，后肢瘫痪，此时，最高临床症状评分可达 4.5分。补阳还五汤组平均起病时间（12.6±0.7）d，临床症状评分为（1.55±0.39）分。两组平均起病时间比较，t=3.45，P=0.003 2，补阳还五汤可明显延迟发病；两组平均最高临床评分比较，t=14，P=0.000 1，补阳还五汤可明显延迟发病，降低EAE临床评分。结果见图1。

2.2 EAE组和BYHWD组脊髓炎性细胞浸润和髓鞘脱失情况比较

2.2.1 HE染色 BYHWD抑制脊髓炎性细胞浸润。在EAE疾病潜伏期：EAE组9 d小鼠的脊髓组织中发现少数炎细胞浸润；BYHWD组9 d小鼠的脊髓组织中无炎细胞浸润。在EAE发病高峰期：EAE组17 d小鼠的脊髓组织中出现大量炎细胞浸润；BYHWD组17 d小鼠的脊髓切面结构清晰，未见明显炎细胞浸润。在EAE发病缓解期：EAE组28 d小鼠的脊髓组织中炎细胞浸润减少；BYHWD组28 d小鼠的脊髓组织中无明显炎细胞浸润。结果见图2。

图2 免疫后第9天、第17天和第28天脊髓HE染色

2.2.2 LFB染色 BYHWD可减少脊髓的髓鞘脱失面积。疾病潜伏期：EAE9 d组中小鼠的脊髓白质较BYHWD9 d组结构疏松；发病高峰期和发病缓解期：分别EAE17 d组、EAE28 d组比较，BYHWD17 d组、BYHWD28 d组小鼠的脊髓白质中髓鞘脱失面积较少。结果见图3。

2.2.3 EAE组和 BYHWD组紧密连接蛋白表达比较 Western Blot法检测小鼠脊髓和脑中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，结果显示，与对应的EAE17 d和EAE28 d相比较，BYHWD9 d、17 d和28 d ZO-1在脊髓和脑中表达量均明显上调（P＜0.001）（图 4、图 5）；与对应的 EAE9 d、EAE17 d和 EAE28 d相比较，BYHWD9 d、17 d和 28 d Occludin 在脊髓中表达量均明显上调（P＜0.001），与对应的EAE9 d、EAE17 d组小鼠比较，BYHWD9 d、BYHWD17 d在脑中 Occludin 高表达（P＜0.001），BYHWD28 d组与EAE28 d组比较表达增高，但差异无统计学意义。结果见图4、图5。

图3 免疫后第9天、第17天和第28天脊髓LFB染色

图4 EAE组和BYHWD组紧密连接蛋白在脊髓的表达

3 讨论

血液和脑组织之间存在血脑屏障（Blood brain barrier，BBB），其由脑毛细血管内皮细胞、基膜和星形胶质细胞突起的脚板构成［13］。脑的毛细血管属连续毛细血管，内皮细胞之间有紧密连接，可以阻止血液中的一些物质转运到中枢，从而保证中枢神经系统内环境的稳定［14］。因此，维持BBB结构的完整性是严格控制大脑化学成分的关键，是神经组织发挥正常功能的重要前提之一。BBB的破坏导致毛细血管通透性增加，使血源中有毒的分子、细胞和微生物制剂进入大脑，它能启动多种神经变性途径［15-16］。

图5 EAE组和BYHWD组紧密连接蛋白在脑的表达

多发性硬化（MS）是一种由 CD4+T淋巴细胞介导的中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病。BBB完整性的破坏在 MS/EAE发病过程中起着关键作用。目前已证实，在MS患者脑中除了外周血巨噬细胞浸润外，还发现T淋巴细胞和B淋巴细胞的大量涌入，这表明BBB的破坏使得循环血液中炎性细胞穿过BBB浸润到中枢神经系统［17］，导致了一系列免疫反应，破坏神经元和少突胶质细胞，造成局部脱髓鞘和神经变性［1，18］。本实验研究发现，EAE9 d小鼠的脊髓组织中发现少数炎细胞浸润，说明在EAE发病的最早阶段就有BBB通透性增加，在EAE发病高峰期17 d小鼠的脊髓组织中出现大量炎细胞浸润，而BYHWD17 d组小鼠的脊髓切面结构清晰，未见明显炎细胞浸润。与 EAE17 d、EAE28 d 比较，BYHWD17 d、BYHWD28 d组小鼠的脊髓白质中髓鞘脱失面积较少。这些结果说明BYHWD可抑制中枢神经系统炎性细胞浸润，减轻髓鞘脱失。

脑血管内皮细胞及其细胞之间的紧密连接是保持血脑屏障的重要因素［19］。紧密连接蛋白主要包括胞质蛋白 ZO-1和跨膜蛋白 Occludin、Claudins等。其中，ZO-1是非常重要的结构蛋白，在紧密连接中起着重要的连接枢纽作用，它将跨膜蛋白与细胞骨架、结构蛋白联系；ZO-1表达水平及活性的高低与紧密连接结构的稳定和细胞功能的完整性密切相关，ZO-1表达水平的高低可以作为BBB功能的标志［14-15］。体外、体内动物模型和患者组织研究的观察结果表明，在MS病理学中，血脑屏障完整性和功能的破坏程度很高［20］。与正常结构的白质相比，在MS病变中，内皮变性，紧密连接蛋白ZO-1不连续地表达［21］。本实验结果显示，与对应的EAE9 d、17 d和 28 d相比较，BYHWD 9 d、17 d和 28 d组，ZO-1 在脊髓和脑中表达量均显著上调，Occluudin在脊髓中表达量均显著上调，表明BYHWD在EAE疾病潜伏期、疾病高峰期和缓解期能通过上调紧密连接蛋白ZO-1和Occluudin的表达，抑制血脑屏障的破坏，抑制中枢炎性浸润，发挥神经保护作用。