二至天癸颗粒对超排卵小鼠GDNF、GFR-1的影响

陈艳花 ，连 方，张雪洛，柳俊珍，崔向荣

（1.山西省妇幼保健院，山西太原030013； 2.山东中医药大学，山东济南250011）

人类辅助生殖技术（Assisted reproductive technology，ART）的发展已经为众多的不孕患者带来了希望，但其临床妊娠率仍在40%左右。提高临床妊娠率已成为近年来研究热点，改善卵母细胞质量，进而提高临床妊娠率成为一个突破口。最近研究显示胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）可以显著增加第一极体排出率，促进卵母细胞成熟［1］。本研究选取经验方二至天癸颗粒，研究对雌性超排卵小鼠GDNF相关指标的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物与分组 健康清洁级未经产8～10 w成熟雌性昆明种小鼠 165只，体质量（30±2）g，山东中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号为SCXK（鲁）20030004。按规定条件饲养，按照随机数字表法将小鼠按1∶1∶1随机分为3组，每组55只。均在动情后期用药。治疗1组［中药配合人绝经后促性腺激素（HMG）取卵组］50只，对照1组（HMG取卵组）50只，空白1组50只（取卵组）；治疗2组（中药配合HMG取胚组）5只，对照2组（HMG取胚组）5只，空白2组5只。

所有小鼠连续每日定时（18∶00）灌胃给药（治疗组用二至天癸颗粒，对照组及空白组用等量生理盐水），第11日18∶00，治疗组与对照组同时腹腔注射HMG10 IU，48 h后治疗1组脱颈处死小鼠，取GV期DOs，观察PB1排出，收集卵母细胞；空白组在相同时间，取GV期卵母细胞。

治疗2组与对照2组小鼠第11日18∶00腹腔注射HMG10 IU，48 h后腹腔注射HCG10 IU，注射HCG同时，将各组第2组5只小鼠按雌雄1∶1比例合笼饲养，次日8∶00观察阴道栓，见阴道栓日为孕1 d，合笼40 h后同上法处死小鼠，解剖取出输卵管，TB针冲洗一端，使受精卵从另一端流出，收集受精卵于含P-1液的四孔培养皿中，观察卵裂、形成囊胚能力情况。空白组于确定发现阴道动情周期当天为第0天，即合笼，第2天晨发现阴道栓后为妊娠第1天。

1.1.2 实验试剂与药品 注射用尿促性素（HMG）：商品名：乐宝得，75 U/支。注射用绒促性素（HCG）：1 000 U/支，均出自丽珠集团丽珠制药厂，产品批号分别为：090202B和090415B。胚胎实验室用液体均为美国Irvine公司产品，引物由山东博尚生物技术有限公司合成。二至天癸颗粒：女贞子、旱莲草、菟丝子、枸杞子、制香附、当归、川芎、白芍、熟地黄、炙甘草等药物组成。由山东中医药大学附属医院制剂室提供（批号：FZ032-03），规格：3 g/袋。

1.2 方 法

1.2.1 动物基本状态 观察3组小鼠的基本外貌及活动状态变化。

1.2.2 动情周期观察［2］本研究中采用小鼠阴道脱落细胞学方法：暴露阴道，用无菌小棉签蘸少许生理盐水，然后在小鼠阴道侧壁上1/3处轻涂，将分泌物涂于玻片上，要求薄而均匀，之后用95%乙醇固定，HE染色，玻片显微镜下观察，每日晨涂片，直到动物处死。

1.2.3 第1组小鼠 GVBD及PB1的观察 GV期裸卵（DOs）的收集：每只小鼠腹腔注射HMG10 IU后48 h，处死小鼠，取出双侧卵巢，肉眼见卵巢增大，卵巢表面突出许多大小不等的卵泡，体视显微镜下用精微仪器尽量去除卵巢周围组织，HTF液中快速洗3遍，在重新换液后扎刺卵泡，释放卵丘-卵母细胞复合物（cumulus-oocyte complexs，COCs），轻轻吹打，使卵母细胞裸露，吸取GV期DOs并移至平衡好的微滴中培养6 h。解剖显微镜下观察GVBD发生情况。GVBD率为已发生GVBD的卵母细胞占全部培养的GV期卵母细胞百分率。GV期卵母细胞在培养后24 h观察PB1的排出，计算PB1排出率。

1.2.4 第2组小鼠受精卵的卵裂及形成囊胚能力将受精卵置于HTF培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养，定时观察受精卵的发育情况。在正常情况下，2 细胞期鼠胚培养 24 h、48 h、72 h、96 h 后分别发育到8细胞期、桑椹胚期、囊胚期及扩张期囊胚。计算囊胚形成率以扩张期囊胚为准。

1.2.5 小鼠卵母细胞 GDNF、GFR-1mRNA 的表达一步法提取卵母细胞总mRNA。RNA浓度和纯度则由紫外分光光度仪来验证。随后合成cDNA。取cDNA第一链作为模板，进行PCR扩增获得244 bp的小鼠GDNF、580 bp的小鼠GFR-1和374 bp的β-actin基因片段。应用Primer Premier 5软件设计RT-PCR扩增引物。DNA电泳观察鉴定后分析图像，并进行光密度定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件包进行统计分析，两组资料组间比较采用t检验；两分类资料采用卡方检验。

2 结果

2.1 小鼠的基本状态及动情周期观察

3组小鼠喂养期间表现基本一致，动情周期4 d左右，均毛发一般、情绪平稳、饮水量适中、大便湿润。注射HMG后仅表现情绪躁动。对照组尤为明显。3组小鼠动情周期完整、正常。

2.2 GV期卵母细胞GVBD率比较

治疗组GV期卵母细胞GVBD率比对照组明显增高（P＜0.05）；治疗组与空白组 GV 期卵母细胞GVBD率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

表1 3组GV期卵母细胞GVBD率比较

2.3 GV期卵母细胞PB1排出率比较

结果见表2。

表2 三组GV期卵母细胞培养后的24 h后PB1排出率比较

由表2可知，治疗组GV期卵母细胞培养后的24 h PB1的排出率比对照组明显升高（P＜0.05）；治疗组与空白组GV期卵母细胞培养后24 h PB1的排出率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 小鼠受精卵卵裂率和囊胚形成率比较

结果见表3、表4。

表3 三组小鼠受精卵卵裂率比较

表4 三组小鼠受精卵囊胚形成率比较

由表3、表4可知，治疗组与对照组小鼠卵裂率及囊胚形成率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），治疗组优于对照组；治疗组与空白组小鼠卵裂率及囊胚形成率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 小鼠卵母细胞GDNF、GFR-1 mRNA表达

本实验中小鼠卵母细胞GDNF mRNA在RTPCR产物电泳条带上未见条带，即GDNF在小鼠卵母细胞上未表达。治疗组与对照组比较，GFR-1 mRNA的表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）治疗组与空白组比较GFR-1 mRNA的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表5、图1。

表5 三组小鼠卵母细胞GDNF、GFR-1 mRNA表达的比较 （±s）

表5 三组小鼠卵母细胞GDNF、GFR-1 mRNA表达的比较 （±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05

组别 n G F R-1表达 t P治疗组 5 0 0.7 0±0.3 0对照组 5 0 0.4 2±0.1 1 1） 6.1 9 6 0.0 0 0空白组 5 0 0.6 6±0.2 4 0.0 1 2 0.9 9 1

图1 GDNF、GFR-1 mRNA表达例图

3 讨论

胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF） 是 Lin LF 等［3］首先从大鼠B49胶质细胞系能发现的一种有活性神经营养因子。定量PCR和免疫组化的结果都表明GDNF的受体GFR-1表达于卵母细胞［4］。对于小鼠排卵前，GDNF、GFR-1在颗粒细胞中的表达量达到最高峰，而卵母细胞内的表达量保持恒定［5］。将GDNF加入体外培养未成熟的卵丘一卵母复合物中，GDNF影响GVBD的发生率，并能显著增加第一极体的排出率，并且呈剂量依赖关系［6-7］。

具有补肾益天癸、养血调冲任功效的二至天癸颗粒组成为菟丝子、女贞子、旱莲草、枸杞子、熟地、当归、川芎、白芍、制香附、炙甘草等，君药：女贞子、菟丝子共用，滋补肝肾益精，直中病机，阴阳并补。臣药：旱莲草、枸杞子、熟地，三药滋补肝肾、填精养血，协助君药共奏清补肾阴之功。佐药：白芍、当归、川芎、制香附，养血疏肝、调达冲任，精血互化，以佐君药滋补肾阴之功。使药甘草调和诸药，以之为使。纵观全方，补益肝肾、调达冲任，正合本病之病机。全方共奏补肾益天癸，调理冲任之效，使肾中阴阳平秘，同时肝肾同源，肝肾并补，精血互化，血旺则精足，肾精盛，天癸充，经候自调，则胎孕可成。

该颗粒具有促卵细胞发育、改善生殖内分泌环境、调整免疫功能及提高子宫内膜容受性的中药整体调节作用［8-9］。药理研究显示，女贞子中所含女贞子多糖能改善环磷酰胺造成小鼠免疫低下模型小鼠的免疫作用与机体的免疫状态有关，对非特异性细胞免疫有增强作用，对正常小鼠的特异性细胞免疫无显著影响，对免疫抑制状态小鼠的细胞免疫有增强作用［10］。齐墩果酸能提高更年期鼠E2、SOD、GSH-Px水平，降低MDA水平；改善卵巢及肾上腺的形态和功能［11］。旱莲草煎剂能增加小鼠胸腺重量，明显提高小鼠碳粒廓清速率，并能增强机体细胞免疫机能，显著提高小鼠外周血中T淋巴细胞百分率［12］。菟丝子具有雌激素样作用［13］，枸杞子具有免疫促进和免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗疲劳的作用，对细胞免疫和体液免疫均具有调节机能。熟地能够抗氧化、抗衰老、调节免疫机能、降血糖、降血脂，对激素代谢等均有影响。两者协同能调节生殖功能。芍药甙对大鼠、豚鼠的离体肠管和在体胃的运动以及大鼠子宫平滑肌均具有抑制作用，芍药甙对大鼠子宫平滑肌具有抑制作用，并能拮抗催产素引起的子宫收缩［14］。川芎嗪是其主要有效活性成分，有较强的扩张微血管、改善微循环、降低血黏度、改善血液流变、降低毛细血管通透性、调节血小板功能和抗凝、抑制自由基产生等药理活性。香附挥发油有轻度雌激素样活性。诸药合用对生殖功能起到改善作用。

本研究提示补肾中药二至天癸颗粒能提高小鼠卵母细胞GFR-1受体的表达，可能直接促进裸卵的GVBD和PB1，提高小鼠卵裂率及囊胚形成率。使小鼠卵母细胞GFR-lmRNA高表达，从而可能更有利于提高小鼠卵母细胞质量，改善胚胎质量。