PMP 柱前衍生化HPLC 法测定黄秋葵多糖的单糖组成

周彦强，吴光斌*，陈发河

（集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361000）

黄秋葵（Abelmoschus esculentus L.）属于锦葵科植物，起源于非洲[1]，在上个世纪90年代引入我国，目前在全国多个地区均有栽培，产量较高[2]。黄秋葵嫩荚中含有丰富的黏性多糖物质，主要是由果胶类多糖、半乳聚糖、阿拉伯聚糖及少量糖蛋白组成[3]。果胶多糖是一种可溶性纤维，它能促进机体内毒素的排泄，降低血糖及胆固醇的含量，也具有一定的抗肿瘤作用[4]。黄秋葵的水溶性果胶具有较高的黏性，前人对其流变学性质、结构单元和乳化性等做了部分研究。Kontogiorgos等[1]研究黄秋葵流变学特性，结果显示具有明显的剪切稀化现象；Sengkhamparn等[5]研究黄秋葵结构单元，发现包含一种特殊的α键连接的鼠李糖-半乳糖交替单元；Georgiadis等[6]研究黄秋葵水包油乳液的流变学特性和稳定性，认为其具有作为乳化剂的潜力。黄秋葵的水溶性果胶还具有类似脂肪的性质，已经被用作脂类的替代物[7]，还有研究称这种特殊黏液可用来制备Lepidimoide（一种类植物激素，属于寡糖类生物活性物质）[8]。

多糖中单糖组分的分析，通常需要用三氟乙酸将多糖降解成单糖再进行测定。目前单糖的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、气相色谱法及高效阴离子交换色谱安培检测法等[9]。薄层色谱法具有操作方便、设备简单、无需衍生化的特点，但是其灵敏度低，分离效果差，仅适用于简单多糖的定性分析。气相色谱法分离效能高、测定快速、灵敏度高；Sengkhamparn等[10]使用气相色谱法分析了黄秋葵多糖的单糖组成。但是糖类化合物和多元醇挥发性和热稳定性较低、沸点高，需对其衍生化后才能用气相色谱法进行分析，而气相色谱法的单糖衍生化反应操作十分复杂，容易产生异构体，也容易受样品杂质的干扰，误差较大。高效阴离子交换色谱安培检测法是糖类技术分析较为理想的方法，它利用糖类化合物的电化学活泼性，单糖可在强碱溶液中呈离子化状态，因此可以使用强碱溶液作为流动相通过阴离子交换从而达到分离效果。潘媛媛等[11]利用此法分析了啤酒和麦汁中的单糖组分，但该法的缺点是分析过程中需要使用较高pH值的流动相，对设备的要求较高，价格昂贵，并且较低的柱容也限制了后续的分析操作。HPLC法用于单糖组成分析时具有分离速度快、分辨率高、重现性好等优点。单糖可以直接使用HPLC法结合通用型检测器进行分析。裘雅渔等[12]使用高效液相体积排阻色谱法配合示差折光检测器分析黄秋葵多糖的单糖组成。刘晓霞[3]使用HPLC配合示差折光检测器分析黄秋葵花中果胶类多糖的单糖组成。但是通用型示差折光检测器灵敏度低，检测限也较高；而另一种通用型检测器蒸发光散射检测器价格昂贵且检测步骤繁琐。单糖分子本身缺少发色基团，无法直接使用紫外或荧光检测器，因此一定程度上限制了单糖的分析检测。有研究将多糖水解后的单糖用发光试剂衍生后再利用HPLC法分离和检测[13-17]，其原理是1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-menthy-5-pyrazolone，PMP）可以在碱性条件下与单糖定量缩合成PMP-单糖衍生物，该物质较为稳定并在波长250 nm处有较强的光吸收[18-20]，这使得紫外检测器可以应用于单糖的分析。本实验将顺序提取的3 种不同黄秋葵多糖经过酸高温水解为单糖，研究PMP柱前衍生化HPLC法测定黄秋葵多糖的单糖组成的分析方法，旨在为黄秋葵多糖的进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜黄秋葵购自厦门市集美区永辉超市，样品购买后去蒂去籽，置于－75 ℃保存备用。

鼠李糖、葡萄糖醛酸（均为色谱纯） 北京索莱宝科技有限公司；甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖（均为分析纯）、NaOH、HCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；岩藻糖（分析纯） 美国Aladdin公司；乙腈（色谱纯）、PMP（纯度≥99.9%） 美国Sigma公司；三氟乙酸（色谱纯） 上海麦克林生化科技有限公司。标准品纯度均不小于98%。

1.2 仪器与设备

2695 HPLC仪（配Waters 2489紫外检测器） 美国Waters公司；PE20K型pH计、LE204E电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；RIOS 8超纯水系统 美国Millipore公司；WB-14恒温水浴锅 德国Memmert公司；ULT1386 －80 ℃超低温冰箱 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.85）：配制0.1 mol/L 磷酸氢钠和0.1 mol/L磷酸二氢钠，混合后调整pH值至6.85；单一标准储备液：配制质量浓度在1.0～1.7 mg/L内的8 种单糖标准品（甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、岩藻糖），4 ℃保存1 周；混合标准溶液：分别移取适量的单一标准储备液混合，然后用超纯水稀释至2、4、8、16、32、64 倍，得到梯度混合标准溶液。

1.3.2 黄秋葵多糖的提取

将黄秋葵冷冻干燥后粉碎，称取黄秋葵粉末10.0 g，再分别使用70%乙醇溶液洗涤（料液比1∶10（g/mL））2 次、三氯甲烷-甲醇溶液（1∶1，V/V）洗涤（料液比1∶15（g/mL））3 次、丙酮洗涤（料液比1∶10（g/mL））2 次，然后烘干，得到醇不溶固形物（alcohol-insoluble solid，AIS）。

使用3 种不同的缓冲溶液对AIS进行顺序提取。每种缓冲液重复提取多次至提取液中的总糖质量浓度低于50 μg/mL，总糖含量的测定使用苯酚-硫酸法[21]。缓冲溶液1为醋酸盐缓冲液（pH 5.2，0.05 mol/L），料液比1∶60（g/mL），70 ℃提取30 min得到热水浸提物（hot buffer soluble solution，HBSS）提取液；缓冲溶液2为草酸钠（0.05 mol/L）、EDTA·2Na（0.05 mol/L）和醋酸钠（0.05 mol/L）的混合溶液，料液比1∶60（g/mL），70 ℃提取30 min得到螯合剂浸提物（chelating agent soluble solution，CHSS）溶液；缓冲液3为NaOH（0.05 mol/L）和硼氢化钠（0.02 mol/L）的混合溶液，料液比1∶60（g/mL），70 ℃提取30 min得到碱提物（dilute alkaline soluble solution，DASS）溶液。

将得到的HBSS、CHSS和DASS溶液使用Sevag溶液（氯仿-正丁醇，5∶1，V/V）反复处理脱去蛋白质；然后透析48 h脱盐，期间换水6 次；旋蒸浓缩后冷冻干燥，得到HBSS、CHSS和DASS多糖样品。

1.3.3 多糖样品的水解

称取多糖样品固体10.0 mg于离心管中，加2 mol/L的三氟乙酸2 mL，氮气封口后于110 ℃水解5 h，旋干水解后的溶液，再利用甲醇洗涤后旋干，继续重复3 次除去残留的三氟乙酸，最后加入10.0 mL蒸馏水得到1.0 mg/mL的样品水解溶液。

1.3.4 衍生处理

取多糖样品的水解液或单糖标准溶液500 μL于试管中，加入0.3 mol/L NaOH溶液500 μL，混合后加入0.5 mol/L PMP-甲醇溶液500 μL，混匀后70 ℃水浴60 min，冷却后加入0.3 mol/L HCl溶液500 μL中和NaOH；然后加氯仿1 mL涡旋30 s，离心后吸弃氯仿层，继续重复萃取2 次以除去多余的PMP，最后过0.22 μm微孔膜备用。

1.3.5 HPLC条件

InfinityLab Poroahell C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，4 μm）；检测波长250 nm；柱温25 ℃；上样量20 μL；流速1 mL/min；流动相为磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 6.85）-乙腈（82∶18，V/V）；洗脱方式为等度洗脱。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2016软件和Empower 2软件对数据进行处理，使用Adobe 3d Reviewer软件和Empower 2软件对图像进行处理。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

考察Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Xbridge Amide C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）和InfinityLab Poroahell C18柱（4.6 mm×150 mm，4 μm），在磷酸盐（pH 6.75）-乙腈溶液（82∶18，V/V）条件下的分离效果。结果显示，Xbridge Amide C18的效果较差，其中半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的分离度均小于1.2；而Symmetry C18和InfinityLab Poroahell C18柱均具有良好的分离效果，8 种单糖组分的分离度均大于1.5。又因InfinityLab Poroahell C18柱的柱长为150 mm，其分析时间短，节省流动相，因此实验选用InfinityLab Poroahell C18柱。

2.2 流动相体系的选择

以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相反相分离PMP-醛糖衍生物时，缓冲液的pH值和乙腈的比例是重要的影响因素。相关文献选用的pH值大多为6.6～6.9[22-24]。实验先使用磷酸盐缓冲液（pH 6.75）-乙腈作流动相，考察乙腈比例分别为16%、17%、18%、19%、20%对单糖衍生物的分离效果。结果表明，乙腈比例越少，8 种单糖的分离度越大，分析时间越长，而PMP的出峰时间受影响较小，这与林钦恒等[25]的研究结果基本一致。当乙腈比例小于18%时，8 种单糖的分离度均大于1.5，实验进一步考察缓冲液的pH值分别为6.65、6.75、6.85、6.95时对8 种单糖的保留时间及分离效果的影响。结果表明，增大pH值可以缩短分析时间，但是过高的pH值会使糖醛酸的出峰时间相对提前，导致葡萄糖醛酸与鼠李糖有重合现象，分离度降低，这与张晓[26]的研究结果基本一致；当使用磷酸盐（pH 6.85）缓冲液-乙腈（82∶18，V/V）溶液进行洗脱时，8 种单糖的分离效果良好，分离度均大于1.5。因此本实验最终选用磷酸盐缓冲液（pH 6.85）-乙腈（82∶18，V/V）溶液作为流动相。在上述优化的色谱条件下对标准品和样品进行测定，如图1所示。

图1 8 种单糖标品（A）、HBSS（B）、CHSS（C）和DASS（D）色谱图Fig. 1 HPLC profiles of mixed eight monosaccharide standards and three polysaccharides

2.3 标准曲线、线性范围和检出限测定结果

将梯度浓度的单糖标准溶液按1.3.4节步骤衍生，在优化的实验条件下进行测定。以各单糖组分的色谱峰峰面积为纵坐标（y）与相应浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，根据信噪比确定检出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）。如表1所示，8 种单糖的相关系数均大于0.999 0，说明线性关系良好；8 种单糖的检出限为0.13～0.45 mg/kg，定量限为0.43～1.49 mg/kg。

表1 单糖组分的标准曲线方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限Table 1 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges, limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) for monosaccharides by HPLC

2.4 回收率与精密度测定结果

在超纯水中分别加入高中低3 个水平的混标，按照1.3.4节方法进行处理，各加标水平平行测定6 次，计算其回收率和相对标准偏差，见表2。结果表明，8 种单糖的加标回收率为94.51%～106.44%，相对标准偏差均小于5%，说明该检测方法准确度好、精密度高。

表2 单糖组分的空白加标回收率（n=6）Table 2 Average recoveries of monosaccharides in spiked pure water (n= 6)

2.5 样品的测定

表3 3 种样品的单糖含量（n=3）Table 3 Monosaccharide composition of three samples (n= 3)

利用本方法对3 种样品进行测定，结果见表3。样品HBSS中含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其物质的量比为0.1∶7.0∶0.4∶5.8∶0.9∶14.6∶1.5；样品CHSS中含有鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖，其物质的量比为4.7∶61.8∶9.6∶5.3，样品DASS中含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其物质的量比为9.5∶5.4∶1.3∶10.8∶2.4∶7.6。

3 讨 论

果胶中含量较高的结构是半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖I（rhamnogalacturonan I，RG I）和鼠李半乳糖醛酸聚糖II （rhamnogalacturonan II，RG II）。其中RG II的分子链较小，并且通常连接于HG的末端，所以在果胶中的含量也较少。对不同植物、植物不同器官或植物细胞中不同位置的果胶，其HG和RG I的比例也不相同[27]。HG结构的主链是半乳糖醛酸；而RG I结构的主链是鼠李糖和半乳糖醛酸的交替结构，2 种单糖的比例为1∶1。根据Alba等[28]的研究，单糖的物质的量比可以反映果胶分子结构包括支链上的差异。使用不同的溶液对黄秋葵进行提取可以得到不同组分的多糖，这可能与多糖在细胞内的存在位置或者多糖与其他物质的结合方式有关[1,4,29]。使用热水浸提得到的HBSS应该是黄秋葵细胞中游离于细胞质或者与细胞壁结合不紧密的多糖，其中高物质的量比的鼠李糖说明其具有很高比例的RG I结构，大量的半乳糖说明其分子链具有较多的分支结构；使用螯合剂提取得到的CHSS应该是黄秋葵细胞中以离子键结合到细胞壁上的多糖，其中具有高比例的半乳糖醛酸，说明其中的果胶结构主要为HG结构，这与螯合剂对离子键的破坏有关；DASS的提取过程使用碱溶液和还原剂，这可能会破坏部分共价键，其结构与HBSS类似，但是其中出现了较多的阿拉伯糖[10]。

此外，根据样品的测定结果，此提取方法可以得到不同结构的多糖，实现多糖的粗分离效果，其主要体现在HBSS和CHSS上。在果胶类多糖中，其酸性和中性糖的差异主要体现在半乳糖醛酸的含量上。对热水浸提后的AIS，使用螯合剂（EDTA和草酸盐）可以屏蔽掉钙离子，这部分半乳糖醛酸含量较高的多糖便被提取出来。此法可以一次性分离得到大量的粗多糖，同时具有速度快的优点。Coimbra等[30]也根据类似的原理进行了橄榄果多糖的分离。

4 结 论

本实验建立PMP柱前衍生HPLC法分析黄秋葵多糖的单糖组成的方法，测定从黄秋葵中顺序提取的3 种不同多糖的单糖组成，确定其物质的量比，样品HBSS中，甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=0.1∶7.0∶0.4∶5.8∶0.9∶14.6∶1.5；样品CHSS中，鼠李糖∶半乳糖醛酸∶半乳糖∶阿拉伯糖=4.7∶61.8∶9.6∶5.3；样品DASS中，甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=9.5∶5.4∶1.3∶10.8∶2.4∶7.6。该方法不仅目标物响应值高、干扰低、稳定，而且与其他方法相比，其检出限更低，准确度和精密度好，灵敏度和回收率高，操作简便，可用于黄秋葵多糖组成的分析，亦可为其他植物材料多糖组成研究提供参考。